La maggior parte dei trascritti del genoma sono RNA non codificanti per proteine. RNA non codificanti

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1 La maggior parte dei trascritti del genoma sono RNA non codificanti per proteine RNA non codificanti large - rrna 18+28S Xist? small - 5S rrna traduzione trna traduzione snrnas splicing snornas modificaz./process. rrna scrnas controllo traduzionale grnas editing pirnas stabilità del genoma mirnas controllo traduzionale sirnas stabilità dell RNA rasirnas silenziamento trascriz.?.

2 Modificazioni dell rrna Metilazione (55 lievito, 110 vertebrati) Pseudouridilazione (45 in lievito, 100 vertebrati)

3 snorna e snornp Gli small nucleolar RNA (piccoli RNA nucleolari o snorna) sono piccoli RNA coinvolti in alcune reazioni di modificazione chimica a carico di rrna e trna Queste modificazioni (metilazione e pseudouridilazione) sono in grado di aumentare l'attività dell'rna maturo. Gli snorna sono RNA di nucleotidi Sono spesso codificati nelle sequenze introniche di proteine ribosomiali oppure sono trascritti indipendentemente come unità policistriniche

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6 snorna e snornp Assieme a proteine costituiscono le small nucleolar ribonucleoprotein (piccole ribonucleoproteine nucleolari o snornp) La funzione dei snorna è quella di guidare il complesso proteico snornp sul sito di modificazione dell'rna bersaglio attraverso un appaiamento specifico mentre la componente proteica esegue la reazione chimica Box C/D Box H/ACA metilazione pseudouridilazione

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8 La proteina Snu13p interagisce con entrambe le box C e D degli snorna e riconosce il motivo di struttura K-turn. Nop1p (la fibrillarina) interagisce con entrambe le box D e D (non mostrato) mentre le proteine Nop58p e Nop56p riconoscono la box D e la box D, rispettivamente. A monte delle box D e D sono mostrate le sequenze guida antisenso e complementari alla molecola di RNA target.

9 Nei loop interni delle strutture a forcina sono presenti le sequenze guida bipartite complementari all RNA target che fiancheggiano i due nucleotidi non appaiati, di cui uno è l uridina che verrà pseudouridilata. Il sito di pseudouridilazione è posizionato a nt a monte delle box H/ACA.

10 Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2006

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12 Maturazione di pre-rrna nei batteri

13 Maturazione di pre-rrna negli eucarioti

14 Tipi di splicing Splicing trna nucleasi e ligasi Splicing di introni di tipo I Splicing di introni di tipo II autosplicing transesterificazioni Splicing nucleare spliceosoma meccanismo simile

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16 Splicing di trna

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20 Autosplicing Introni di gruppo I e II

21 Confronto dei meccanismi di splicing Tutti i tipi di spicing comportano due reazioni di trans-esterificazione irreversibili per degradazione dell introne

22 Tutti gli introni di gruppo I e II sono caratterizzati da una complessa struttura tridimensionale, essenziale per il loro meccanismo di azione (autocatalisi)

23 Introni di gruppo I

24 Lo splicing degli introni del gruppo I riguarda principalmente i geni che codificano rrna, trna e mrna degli organelli di funghi e piante Struttura dell introne dell rrna di Tetrahymena In vivo sono necessari fattori proteici per il corretto ripiegamento dell RNA Proteine codificate dagli introni stessi

25 Lo splicing degli introni del gruppo I richiede l intervento di una guanosina esterna (GTP) che si lega in una tasca dell introne che deve essere rimosso (sito di legame G)

26 Il GTP attacca con il gruppo 3 OH il fosfato del sito di splicing al 5 (di solito U) Reazione di trans-esterificazione Liberazione dell esone al 5 e legame del GTP all estremità 5 dell introne All estremità 5 dell introne c è un residuo di guanina che si lega al sito di legame G Reazione di esterificazione L estremità 3 -OH del primo esone attacca il legame estere al sito 3 di splicing unendosi così al secondo esone e liberando l introne

27 Introni di gruppo II

28 Introni di gruppo II sono meno comuni degli introni di gruppo I si trovano nei genomi degli organelli di funghi e piante (la maggior parte negli introni dei cloroplasti) la reazione di self-splicing è molto più lenta di quella degli introni di gruppo I Meccanismo di azione Il meccanismo è diverso da quello degli introni di gruppo I e somiglia a quello utilizzato dallo spliceosoma negli mrna eucarioti le giunzioni di splicing al 5 (GUGYG) e al 3 (AY) sono conservate L RNA si ripiega in una struttura conservata con la formazione di un sito attivo che lega ioni Mg+2 Sei domini a doppia elica attorno a un core centrale Non utilizzano una guanosina esterna ma un residuo interno di adenosina (presente nel VI dominio)

29 Struttura generale degli introni di gruppo II Le frecce indicano le giunzioni esone-introne L esone è tratteggiato Un residuo di Adenina nell introne guida l attacco nucleofilo (step 1).

30 splicing degli introni del gruppo II in mrna mitocondriali, di cloroplasti, funghi, piante In vivo sono necessarie proteine per il corretto ripiegamento dell RNA

31 Il 2 OH del residuo di adenosina attacca il fosfato della giunzione al 5 formando un legame 2-5 con la prima base dell introne (G) reazione di trans-esterificazione L esone a monte viene liberato mentre l introne assume una struttura a cappio (lariat) L esone a monte attacca con la sua estremità 3 OH la giunzione di splicing al 3 reazione di esterificazione La reazione porta alla giunzione dei due esoni e la liberazione dell introne a cappio Processo a due step

32 Splicing nucleare

33 Il DNA non codificante è quindi quella parte di genoma che maggiormente varia al variare della complessità INTRONI UTRs REGIONI INTERGENICHE

34 DNA -> RNA eterogeneo (hnrna) -> mrna Il passaggio hnrna -> mrna consiste in: Incappucciamento: alterazioni chimiche all estremità 5 Splicing : rimozione degli introni Poliadenilazione: sostituzione dell estremità 3 con un estensione di circa 250 basi A non presenti nella sequenza del gene Introni/Esoni Esistono almeno 8 tipi diversi di introni Quello associato in modo predominante ai geni che codificano proteine segue la regola GU-AG (cioè: introne = GU* *AG) Esistono delle regole ben precise che determinano la rimozione precisa degli introni Splicing alternativo

35 mrna Modifiche al 5 e al 3

36 mrna Modifiche durante la trascrizione

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38 SCAF: splicing complex associated factors

39 Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2006

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41 Esoni e domini funzionali delle proteine

42 Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2006

43 Le giunzioni di splicing sono conservate

44 Sequenze minime di consenso di spicing, numero minimo di complementarietà Mutazioni in questa regione alterano lo splicing

45 Lo splicing degli mrna richiede lo spliceosome un complesso RNA-proteine spliceosome (~100 proteins + 5 small RNAs) pre-mrna spliced mrna

46 U1 snrna snrna (smal nuclear RNA) U2 snrna U4 snrna U5 snrna U6 snrna I 5 snrna sono associati a proteine formando complessi ribonucleoproteici chiamati snrnp

47 Lo spliceosoma 5 RNA e più di 200 proteine (7 comuni) (snurp snrnp) formano lo spiceosoma

48 The spliceosome is a ribonucleoprotein complex composed of multiple snrnps

49 Lo spliceosomea

50 Il complesso snrnp U1

51 Interazioni tra sequenze introniche e snrna U1 = sito di splicing 5 U2 = sito di ramificazione U6 = sito di splicing 5

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53 Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2006

54 Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2006

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56 Formazione del complesso di pre-splicing (complesso early) (5 appaiamenti) con U1 Py:polipirimidina SC35, ASF/SF2 auxiliary splicing factor fattori di splicing ricchi di ser/arg

57 Due vie per la definizione delle giunzioni Riconoscimento del sito donatore più stringente

58 Tappe iniziali dello splicing del pre-mrna Complesso A: assembling U2 sul sito di ramificazione richiede ATP Complesso B: binding

59 Tappa finale dello splicing Complesso C: catting reazioni di transesterificazione U6 si lega a U2 con una struttura a forcina

60 The spliceosomal splicing cycle La composizione dello spliceosoma cambia nel corso dello splicing

61 Regolazione dello splicing Difetti nello splicing implicati in numerose malattie Splicing alternativo fonte di variazione genetica e meccanismo di regolazione di attività cellulari

62 Conseguenze di mutazioni delle sequenze consenso di splicing

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64 Fattori che modulano lo splicing Proteine con motivi DEXH/D box: RNA-elicasi ATP-dipendenti Svolgimento di brevi tratti a doppia elica presenti nel pre-mrna Proteine SR (ricche in Ser e Arg fosforilabili): proteine modulari con dominio di legame per l RNA (RRM) e dominio RS Legame a elementi di enhancer di splicing per stimolare il legame di U2AF Legame ai siti di ramificazione per stimolare il legame di U1 al sito 5 Sequenze enhancer e silenziatori di splicing esoniche (ESE e ESS) Sequenze enhancer e silenziatori di splicing introniche (ISE e ISS) Richiamano rispettivamente le proteine SR (attivatori che richiamano U2AF) o le proteine hnrnp (inibitori che impediscono il legame dello spliceosoma)

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66 regolazione positiva dello splicing

67 controllo negativo del sito di splicing

68 Splicing alternativo

69 Splicing alternativo Scoperto inizialmente nel 1980 Meccanismo sottoposto a regolazione cellularte anche se può essere casuale Il gene Dscam di Drosophila può avere sino a differenti variani di splicing Gene DSCAM (codifica per una proteiba della superficie cellulare coinvolta nella connettività tra neuroni) Il gene DSCAM è lungo 61.2 kb e dopo la trascrizione e lo splicing produce un mrna di circa 7.8 kb composto da 24 esoni. Gli esoni 4, 6, 9, e 17 sono mutualmente esclusivi e alternativi. Ogni mrna finale prodotto contiene una delle12 possibile alternative dell esone 4, una delle 48 possibili per l esone 6, una delle 333 possibili per l esone 9 e una delle 2 possibili per l esone 17. Tutte le possibili combinazioni dei singoli esoni 4, 6, 9, e 17 permettono di ottenere diverse varienti dell mrna per il gene DSCAM e quindi altrettante proteine diverse.

70 Implicazioni nell evoluzione Lo splicing alternativo modifica l espressione del genoma aumentandone la complessità Quante proteina sono prodotte dai genomi eucariotici? Quanti geni sono necessari per un organismo pluricellulare complesso? Come le varianti di splice contribuiscono all evoluzione? Quanto sono stabili i siti di splicing durante l evoluzione?

71 Possibili effetti dello splicing alternativo Inclusione/esclusione di domini funzionali che possono modificare la funzione o la localizzazione Variazioni nella struttura proteica Variazioni nella regione 5 non tradotta che modificano l efficienza di traduzione Variazioni nella sequenza di poliadenilazione che alterano la stabilità dell mrna

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73 Diverse tipologie di splicing alternativo proteoma più vario e complesso del trascrittoma

74 Many cellular factors may affect which splice variant is produced Pre-mRNA RNA binding proteins Pre-RNA secondary structure Small ncrnas? Protein:protein complexes Other mrnas? mrna 1. The phenotype is determined by the proteome & transcriptome. 2. Selection acts on the phenotype, and is blind to the genotype. Therefore: two species/individuals that have different forms of a protein will be selected differently - even if the genes DNA sequence is identical.

75 CAMKII (chinasi II calmodulina dipendente Caspasi Segnali pro e anti apoptotici Attività simile ma diversa localizzazione Fattore di trascrizione Zn-finger Espresso in alcuni neuroni sensori Controllo del comportamento Gene fru S = esone a splicing specifico P = promotori alternativi sarcolemma nucleo citosol

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77 multiple introns may be spliced differently in different circumstances, for example in different tissues. Heart muscle Uterine muscle Thus one gene can encode more than one protein. The proteins are similar but not identical and may have distinct properties. This is important in complex organisms

78 Splicing alternativo della tropomiosina

79 scelta di un diverso promotore

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81 Trans-splicing

82 Trans-splicing Trans-splicing di gruppo II discontinuo mitocondri vegetali Scambio di tratti di DNA tra regioni geniche differenti Trans-splicing di leader attaccato tripanosomi fornisce una presequenza al 5 Cappuccio a RNA trascritti dalla RNApol I o III Utile per trascritti policistronici Efficienza di traduzione (5 non tradotto dell RNA coinvolto nel legame con i ribosomi) Trans-splicing del t-rna Alcuni organismi Ricongiungere le due metà del trna presenti in due regioni geniche differenti

83 RNA-editing Inserzione di U (Tripanosomi) Conversione A>I e C>U (mammiferi)

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86 RNA guida Terminal-Uridil- Trasferasi Ribonucleasi 3 ->5 U-specifica

87 Editing nei mammiferi ADAR

88 Editing differente nei due tessuti ApoB-100 -> trasporto lipidi (LDL) ApoB48 -> assorbimento lipidi AA L editing richiede APOBEC1 = attività catalitica ACF = fornisce la specificità del sito AA AA Stop Stop Stop