RNA Processamento/maturazione

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1 RNA Processamento/maturazione

2 Maturazione dell RNA Aggiunta di sequenze non codificate dai geni corrispondenti Rimozione di sequenze dai trascritti primari Modificazioni covalenti di basi

3 Major RNA processing mechanisms in prokaryotes ribosomal RNA (i) methylation (ii) nucleolytic cleavage messenger RNA no significant modification transfer RNA (i) 5 - and 3 -cleavage (ii) CCA addition (iii) base modification

4 Major RNA processing mechanisms in eukaryotes ribosomal RNA (RNA polymerase I transcripts) (i) methylation (ii) nucleolytic cleavage messenger RNA (RNA polymerase II transcripts) (i) 5 -capping (ii) 3 -cleavage and polyadenylation (iii) removal of introns (nuclear splicing) transfer RNA (RNA polymerase III transcripts) (i) 5 - and 3 -cleavage (ii) CCA addition (iii) base modification (iv) trna splicing

5 mrna di procarioti ed eucarioti

6 mrna di procarioti ed eucarioti

7 STRUCTURE OF EUKARYOTIC mrna 5 Cap 7mGpppN 5 untranslated region initiation AUG translated region 3 untranslated region UGA termination polyadenylation signal AAUAAA (A) ~200 poly(a) tail 3 all mrnas have a 5 cap and all mrnas (with the exception of the histone mrnas) contain a poly(a) tail

8 Fattori per la maturazione e il processamento del mrna Il dominio carbossiterminale della PolII (CTD) fosforilato recluta gli enzimi per il capping, lo splicing e la poliadenilazione. Il capping viene effettuato subito dopo l inizio della sintesi del mrna

9 ACCOPPIAMENTO TRASCRIZIONE-PROCESSAMENTO mrna Berg J, Tymoczko JL, Stryer L. Biochimica- Zanichelli 6 ed

10 The mrna 5 -cap structure Functions: (i) marks the 5 -end of the first exon and aids in the splicing process (ii) essential for nucleo-cytoplasmic transport of mrnas through interaction with nuclear capbinding proteins (iii) increases the efficiency of translation by targeting formation of the preinitiation complex (cytoplasmic cap-binding proteins) (iv) protects the transcript from 5 3 exoribonucleolytic activities Nelson & Cox, 2005, p. 1008

11 RNA Capping Nelson & Cox I principi di Biochimica di Lehninger- Zanichelli 6 ed.

12 POLIADENILAZIONE 3 terminale di mrna eucariotici Nelson & Cox I principi di Biochimica di Lehninger- Zanichelli 6 ed.

13 Identification of introns by R-looping

14 Synthesis and processing of ovalbumin mrna Nelson & Cox, 2005, p. 1013

15 Splicing Esempio: mrna β-globina

16 General features of nuclear introns Consensus sequences around 5 and 3 splice sites in vertebrate pre-mrnas. Lodish H. Molecular Cell Biology-W.H. Freeman and Company-4th ed

17 Le reazioni dello splicing (1) Exon 1 Intron 1 Exon 2

18 Le reazioni dello splicing (2)

19 Le reazioni dello splicing Lo splicing avviene mediante due reazioni di transesterificazione I II Lodish H. Molecular Cell Biology-W.H. Freeman and Company-4th ed

20 RNA splicing is carried out by a large complex called spliceosome The splicing of introns from premrna are mediated by the spliceosome. The spliceosome comprises about 150 proteins and 5 snrnas. Many functions of the spliceosome are carried out by its RNA components.

21 The five RNAs (U1, U2, U4, U5, and U6, nt) are called small nuclear RNAs (snrnas). The complexes of snrna and proteins are called small nuclear ribonuclear proteins (snrnp, pronounces snurps ). The spliceosome is the largest snrnp, and the exact make-up differs at different stages of the splicing reaction.

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23 Interactions between pre-mrna, U1 snrna, and U2 snrna early in the splicing process. Lodish H. Molecular Cell Biology-W.H. Freeman and Company-4th ed

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25 Spliceosoma inattivo Spliceosoma attivo ATP ADP + Pi

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28 Errori di splicing Un esone può essere saltato Si possono usare siti criptici

29 RNA processing mutations associated with β-thalassemia Molecular Biology of the cell- fourth edition

30 Difetti nella biogenesi delle snrnp-patologia L atrofia muscolare spinale (SMA) è la più comune causa genetica di mortalità infantile avente come caratteristica la perdita selettiva degli α- motoneuroni. La SMA è causata da mutazioni o delezioni nel gene survival motor neuron 1 (SMN1). SMN gioca un ruolo essenziale nell assemblaggio e nella rigenerazione delle snrnps (small nuclear ribonucleoprotein) spliceosomali in tutti i tipi cellulari.

31 Oltre il 90% dei geni umani è in grado di esprimere più di un trascritto (ed è quindi soggetto a splicing alternativo). Le diverse isoforme di splicing possono avere specificità a livello di tessuto e di condizione fisiologica.

32 Esempi di splicing alternativo e siti alternativi di poliadenilazione GENE TROPOMIOSINA

33 Splicing alternativo Fibronectine tessuto-specifiche Lodish H. Molecular Cell Biology-W.H. Freeman and Company-4th ed L eliminazione degli esoni EIIIB ed EIIIA rende la fibronectina secreta dagli epatociti non aderente alla superficie cellulare e, quindi, solubile; essa tuttavia è in grado di legare la fibrina dei coaguli e, in tale stato, fa da ponte con le integrine sulla superficie delle piastrine attivate contribuendo all ingrandimento del coagulo.

34 SPLICING ALTERNATIVO DEL TRASCRITTO PRIMARIO DEL GENE DELLA CALCITONINA Calcitonina= ormone che riduce la concentrazione del Ca2+nel plasma, prodotto dalla tiroide CGRP= peptide correlato alla calcitonina, potente vasodilatatore che può intervenire nella trasmissione del dolore, prodotto dal sistema nervoso periferico e centrale

35 Tissue-specific processing of the calcitonin primary transcript Nelson & Cox. Lehninger: Principles of Biochemistry- W.H. Freeman and Company 6th edition.

36 SPLICING ALTERNATIVO Anticorpi solubili o legati alla membrana Lo splicing alternativo puo produrre due tipi di anticorpo diversi con la stessa specificita Quando attivati dall antigene i linfociti B cominciano a produrre anticorpi solubili Le forme secrete mancano di domini idrofobici

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39 SPLICING ALTERNATIVO: ISOFORME DELLA TROPONINA T

40 Modificazioni post-trascrizionali RNA EDITING Modificazione della sequenza del mrna dopo che e stato trascritto Esempio: messaggero apolipoproteina b

41 Le lipoproteine Associazione dei lipidi del plasma (colesterolo, esteri del glicerolo, trigliceridi e fosfolipidi) con apolipoproteine Funzione principale: trasporto dei lipidi e delle sostanze idrofobiche nel sangue ai vari tessuti e organi. Struttura globulare, differiscono per densità, composizione lipidica e proteica (apolipoproteine). Sintetizzate principalmente nel fegato e nell intestino

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43 Classificazione delle lipoproteine Mediante ultracentrifugazione sono separabili in base alla loro diversa densità: CM VLDL IDL LDL HDL Maggiore proteina Maggior lipide ApoB 48 ApoC-III ApoE ApoB100 TG TG CE CE CE ApoA-I (70%) ApoA-II (20%) ApoA-IV, ApoC, ApoD, ApoE (10%) CM = chilomicroni, tra le lipoproteine hanno < densità e > diametro. Raccolgono i TG e il colesterolo a livello dell intestino tenue. Sono presenti pressochè solo dopo i pasti. VLDL = (very low density lipoproteins) raccolgono TG e CE a livello del fegato IDL = (intermediate density lipoproteins) ciò che resta delle VLDL dopo che hanno dato TG al tessuto adiposo e muscolare LDL = (low density lipoproteins) ciò che resta delle IDL, definite colesterolo cattivo HDL = (high density lipoproteins) definite colesterolo buono Apo = apolipoproteina TG=triglyceride CE= cholesteryl ester

44 Editing del RNA: variazione della sequenza nucleotidica del RNA dopo la trascrizione esempio: mrna apolipoproteina B Lodish H. Molecular Cell Biology-W.H. Freeman and Company-4th ed

45 Regolazione genica post-trascrizionale

46 Livelli di regolazione genica degli Eucarioti -Controllo del trasporto del mrna nel citoplasma -legame a proteine di trasporto -degradazione intra-nucleare -Controllo della localizzazione citoplasmatica dell mrna -ruolo del citoscheletro -Controllo della stabilità (ossia della vita media) dell mrna -regioni ricche di AU, come (AUUA) sono associate a breve emivita dell mrna -presenza coda polya, stabilizzazione con PAB, formazione di un complesso ad anello, ruolo di fattori accessori -degradazione mediata dal prodotto -Small Interfering RNAs e micro-rnas

47 Stabilita dell RNA messaggero Translation initiation complex

48 La stabilità dell mrna citoplasmatico è variabile Lodish H. Molecular Cell Biology-W.H. Freeman and Company-4th ed

49 The destabilizing effect of AUUUA sequences on mrna half-life (t 1/2 ) Lodish H. Molecular Cell Biology-W.H. Freeman and Company-4th ed

50 Mechanisms of cytoplasmic mrna turnover

51 RNA degradation of EukaryotesmRNA surveillance Degradation of mrnas that have a termination codon at an incorrect position The incorrect codon is thought to be detected by a surveillance mechanism that involves a complex of proteins which scans the mrna Incorrect termination codon induces cap cleavage and 5 3 exonuclease degradation

52 SEGNALE AMBIENTALE (IL FERRO) E CONTROLLO DELLA SINTESI DI PROTEINE NECESSARIE PER IL SUO METABOLISMO. Ferritin (Stoccaggio) Sangue Fe 2+ Transferrin receptor (ingresso) Transferrin (trasporto) Fe 3+ Quando il ferro e in eccesso la cellula deve diminuire il livello del recettore e aumentare quello della ferritina. Regolazione della stabilita mrna del Recettore per la transferrina e della traduzione del mrna della Ferritina ad opera della IRE-BP

53 CONTROLLO DEI LIVELLI DI FERRO NELLA CELLULA Il ferro e un nutriente essenziale La cellula lo usa per : citocromi, emoglobina e molti enzimi. Il ferro in eccesso e causa di formazione di radicali liberi Quindi il livello di ferro deve essere controllato accuratamente.

54 Berg J, Tymoczko JL, Stryer L. Biochimica- Zanichelli 6 ed La proteina IRE-BP è una aconitasi: la proteina è un sensore del ferro. L aconitasi presenta un centro 4Fe-4S instabile. Quando la concentrazione di ferro è bassa il centro 4Fe-4S si dissocia, la proteina cambia in conformazione e può interagire con molecole di mrna (regioni IRE).

55 Regolazione Ferro-dipendente della stabilità dell mrna del recettore della transferrina +Fe -Fe Lodish H. Molecular Cell Biology-W.H. Freeman and Company-4th ed In presenza di basse concentrazioni di ferro IRE-BP si lega agli elementi di risposta al ferro (IRE) che si trovano nella regione non tradotta al 3, impedendo la degradazione dell mrna.

56 REGOLAZIONE FERRO-DIPENDENTE DELLA TRADUZIONE DEL mrna DELLA FERRITINA +Fe -Fe Lodish H. Molecular Cell Biology-W.H. Freeman and Company-4th ed La proteina che si lega a IRE (IRE-BP) inibisce la produzione della catena pesante della ferritina legandosi agli elementi di risposta al ferro (IRE) che si trovano nelle regioni non tradotte al 5.

57 Regulation by iron (Fe):

58 I geni eucariotici non trascritti dalla Pol II Lodish H. Molecular Cell Biology-W.H. Freeman and Company-4th ed

59 Maturazione dei trascritti di pre-rrna nei vertebrati Nelson & Cox, Zanichelli ed.2014

60 Excision of mature rrna and trna from pre-rrna in E. coli Genes: 16S rrna trna 23S rrna 5S rrna trna Promoters 30S pre-rrna: Transcription Terminators Cleavage at Further trimming 16S rrna trna 23S rrna 5S rrna trna

61 trna processing Nelson & Cox. Lehninger: Principles of Biochemistry- W.H. Freeman and Company 4th edition.

62 Modified bases present in trnas Nelson & Cox. Lehninger: Principles of Biochemistry- W.H. Freeman and Company 6th edition.

63 Rimozione introni dai trna