SUPERAVVOLGIMENTO DEL DNA (ORGANIZZAZIONE TERZIARIA DEL DNA)

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1 SUPERAVVOLGIMENTO DEL DNA (ORGANIZZAZIONE TERZIARIA DEL DNA)

2 ORGANIZZAZIONE TERZIARIA DEL DNA Il DNA cellulare contiene porzioni geniche e intergeniche, entrambe necessarie per le funzioni vitali della cellula GENE: regione del DNA che codifica la sequenza primaria di un prodotto genico finale, che può essere un polipeptide o una molecola di RNA con una specifica funzione strutturale o catalitica Oltre ai geni il DNA contiene segmenti o sequenze con funzioni regolatrici SEQUENZE REGOLATRICI: segnali che indicano l inizio o la fine dei geni, che influenzano la trascrizione dei geni, funzionano da inizio della replicazione o della ricombinazione

3 Le molecole di DNA sono molto più lunghe degli involucri che le contengono Rivestimento proteico del batteriofago T2 circondato dalla sua molecola lineare di DNA (batteriofago lisato) Nel batteriofago non lisato tutto il DNA è normalmente impaccato nella testa del fago

4 Le molecole di DNA sono molto più lunghe degli involucri che le contengono La lunghezza totale del DNA di E.coli è circa 1 mm mentre la lunghezza della cellula batterica è circa 1µm La lunghezza totale della molecola di DNA umano è circa 2m, ma questa molecola deve stare in un nucleo di circa 10-15µm di diametro

5 Il DNA cellulare deve essere strettamente compattato, il che implica un elevato grado di organizzazione strutturale Il meccanismo di ripiegamento non deve soltanto impacchettare il DNA, ma deve anche permettere l accesso all informazione contenuta nel DNA per lo svolgimento di processi quali replicazione e trascrizione

6 Un importante proprietà intrinseca della struttura terziaria del DNA è il SUPERAVVOLGIMENTO = AVVOLGIMENTO DI QUALCOSA GIA AVVOLTO Il DNA è avvolto in forma di una doppia elica nella quale entrambe le catene avvolte ruotano intorno a un asse. Un ulteriore ripiegamento o una torsione di tale asse su se stesso determinano un superavvolgimento del DNA. Il superavvolgimento del DNA è in genere la manifestazione di una tensione strutturale; è ubiquitario nel DNA cellulare ed è strettamente regolato in ogni cellula.

7 ORGANIZZAZIONE DEL DNA EUCARIOTICO IN CROMOSOMI Nella cellula, il DNA è associato a proteine per formare un complesso chiamato CROMOSOMA

8 Il termine cromosoma indica in generale una molecola di acido nucleico depositaria dell informazione genetica di un virus, un batterio, una cellula eucariotica o un organello. La parola deriva dal greco: χρῶµα (chroma, colore) and σῶµα (soma, corpo) a causa della proprietà dei cromosomi di essere colorate intensamente da particolari coloranti. Per questa ragione questo termine è stato originariamente usato per indicare le inclusioni densamente colorate all interno dei nuclei eucariotici che possono essere visualizzate al microscopio ottico dopo che le cellule sono state sottoposte a colorazione.

9 L organizzazione strutturale del DNA eucariotico a livelli superiori alla struttura secondaria comporta la sua SPIRALIZZAZIONE Il livello di condensazione è diverso nelle varie fasi del ciclo cellulare La struttura dei cromosomi può essere studiata solo durante la mitosi, quando essi formano strutture più compatte. Durante l interfase la maggior parte dei cromosomi sono troppo despiralizzati e sottili perché si possa osservarne l organizzazione strutturale. La determinazione del tipo di spiralizzazione del DNA in ciascun cromosoma sembra essere una delle funzioni delle regioni non codificanti del DNA, di cui non è ancora completamente noto il ruolo funzionale

10 La spiralizzazione del DNA nelle cellule eucariotiche è importante - per disporre in modo ordinato all interno del nucleo le lunghissime catene di DNA - la precisione con cui in una determinata cellula una regione del genoma è ripiegata può influenzare in modo decisivo l attività dei geni in questa regione Un ruolo fondamentale nel processo di ripiegamento del DNA negli eucarioti è svolto da proteine specializzate

11 Le proteine associate al DNA possono essere: - ENZIMI che catalizzano importanti reazioni quali la sintesi di RNA - PROTEINE CON FUNZIONI STRUTTURALI che servono ad organizzare il DNA all interno del nucleo Le proteine che, negli eucarioti, si legano al DNA sono classificate in - ISTONI (proteine strutturali) - PROTEINE CROMOSOMICHE NON ISTONICHE (migliaia di proteine diverse con numerose differenti funzioni)

12 ISTONI Presenti nelle cellule in quantità enorme (circa 60 milioni di copie di ciascun tipo per cellula) La loro massa complessiva è quasi uguale a quella del DNA presente nella cellula Proteine relativamente piccole contenenti una quantità elevata di aa con cariche positive (Arg e Lys) che favoriscono la formazione di uno stretto legame con il DNA, indipendentemente dalla sequenza nucleotidica del DNA stesso. Il DNA legato agli istoni si chiama CROMATINA

13 -ISTONI NUCLEOSOMICI: piccole proteine responsabili del ripiegarsi del DNA nei nucleosomi H2A, H2B, H3, H4 Sono fra le proteine meglio conservate durante l evoluzione -ISTONE H1: eccettuato il nucleo centrale della molecola, le sequenze aminoacidiche sono meno conservate.

14 L unità strutturale della cromatina è il NUCLEOSOMA, responsabile dell aspetto a filo di perle che la cromatina mostra al microscopio elettronico quando è stata trattata in modo da distendere le ripiegature di ordine superiore

15 Il nucleosoma è stato descritto da Roger Kornberg nel 1974 nucleo istonico: ottamero formato da due copie di ciascun istone H2A, H2B, H3, H4 tratto di DNA che avvolge il nucleo istonico: 147bp tratto di DNA di collegamento: 20-60bp Le code N-terminali degli istoni nucleosomici sporgono esternamente al nucleosoma Il compattamento del DNA in nucleosomi produce un filo di cromatina di circa 10nm di diametro

16 Il legame dell istone H1 porta ad un maggior compattamento del nucleosoma H1 si lega sia al nucleosoma che al DNA linker Le molecole di istone H1 si legano al DNA in maniera COOPERATIVA

17 Gli istoni H1 aiutano i nucleosomi a condensarsi nella fibra di 30nm

18 Le code N-terminali degli istoni del nucleosoma stabilizzano la fibra di cromatina di 30nm.

19 Poiché la condensazione in fibre di cromatina di 30 nm riduce le dimensioni della molecola di DNA di circa 40 volte, è necessaria un ulteriore condensazione I livelli di ripiegamento successivi alla fibra di 30 nm non sono ancora stati completamente chiariti. Implicano la presenza di REGIONI AD ANSA: alcune regioni del DNA si associano con un impalcatura nucleare costituita da diverse proteine non ancora completamente identificate (probabilmente H1 e topoisomerasi) Le proteine si legano al DNA riconoscendo probabilmente sequenze specifiche che formano il collo di ciascuna ansa

20 Il tratto di DNA che forma un ansa può contenere un gruppo di geni correlati tra loro ed è lungo da e bp; ciò significa che un tipico cromosoma umano può contenere circa 2600 regioni ad ansa ed ogni ansa di cromatina è formata da un tratto della fibra di 30 nm lungo in media circa 4000 nm A questo punto la molecola di DNA avrebbe la lunghezza di circa 100 µm; deve quindi ripiegarsi ulteriormente per poter rimanere all interno del nucleo

21 Esistono evidenze sperimentali a favore dell esistenza di ulteriori livelli di organizzazione nei cromosomi eucariotici, ognuno dei quali determina un aumento esponenziale del grado di compattezza. La spiralizzazione del DNA è accompagnata dalla fosforilazione di tutte le molecole di H1 della cellula a livello di cinque diverse specifiche molecole di serina. I progressivi gradi di compattezza variano probabilmente da cromosoma a cromosoma, da una regione all altra di un singolo cromosoma, da un istante all altro nella vita della cellula. Ad oggi, nessun modello è in grado di descrivere adeguatamente questa struttura. LA COMPATTEZZA DEL DNA DEL CROMOSOMA EUCARIOTICO E VEROSIMILMENTE DOVUTA AD AVVOLGIMENTI SUCCESSIVI CHE SI SOVRAPPONGONO AD AVVOLGIMENTI GIA PRESENTI Modello di compattamento del DNA in un cromosoma eucariotico

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23 Oltre alle proteine istoniche, altre proteine si legano al DNA a livello di sequenze specifiche (PROTEINE CROMOSOMICHE NON ISTONICHE) Sono PROTEINE REGOLATRICI Regolano il processo di trascrizione, l inizio della sintesi del DNA, il ripiegamento della molecola in regioni funzionalmente distinte

24 I nucleosomi limitano l accesso delle proteine regolatrici alle specifiche sequenze di DNA alle quali esse si legano. Nel caso di alcune proteine regolatrici, il legame è possibile solo se quel certo tratto di DNA è completamente privo di nucleosomi o se il loro sito di legame si trova nel DNA linker. Questo fa ipotizzare che in alcune regioni della cromatina i nucleosomi non sono disposti a caso, ma in modo da lasciare relativamente libere quelle sequenze di DNA che devono essere riconosciute da altre proteine cellulari. La disposizione dei nucleosomi a livello di specifiche sequenze è detta MESSA IN FASE O POSIZIONAMENTO DEI NUCLEOSOMI

25 L interazione del DNA con l ottamero istonico è dinamica Il nucleosoma può muoversi per permettere l accesso delle proteine regolatrici alle loro sequenze di legame in risposta alle diverse richieste di accessibilità (Rimodellamento del nucleosoma).

26 Modificazioni delle code N-terminali degli istoni influenzano l accessibilità alla cromatina

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28 In che modo le modificazioni degli istoni alterano la funzione dei cromosomi? - L acetilazione o la fosforilazione riducono le cariche positive e quindi l affinità delle code istoniche per il DNA - Modificazioni delle code istoniche (in particolare l acetilazione) riducono la capacità del DNA di condensarsi nella fibra di 30 nm. - Alcune modificazioni favoriscono la formazione di siti di legame per proteine regolatorie

29 Le modificazioni degli istoni formano un codice che può essere letto dalle proteine coinvolte nell espressione genica o in altre reazioni a carico del DNA

30 Quindi.. le modificazioni a livello delle code istoniche e i processi di rimodellamento dei nucleosomi lavorano insieme per determinare l accessibilità delle diverse regioni del DNA Passaggio da: eterocromatina trascrizionalmente silente a: eucromatina trascrizionalmente attiva

31 La metilazione del DNA avviene per trasferimento di un gruppo metile da S-adenosilmetionina alla posizione 5 della citidina da parte di enzimi della famiglia delle DNA metiltrasferasi (DNMT). Nei mammiferi sono normalmente metilate citidine seguite da guanosine (CpG). Possono essere metilate anche citidine seguite da altre basi, in particolare adenine (CpA). Nei mammiferi sono metilate tra il 60% ed il 90% delle sequenze CpG. Sequenze CpG non metilate sono raggruppate in clusters chiamati Isole CpG " che sono presenti nelle regioni regolatorie al 5 di molti geni.

32 Gli effetti della metilazione del DNA sull espressione genica si esplicano attraverso meccanismi di diverso tipo e portano generalmente alla riduzione dell espressione genica, chiamata silenziamento genico In generale: La metilazione del DNA si inserisce nel contesto delle modificazioni chimiche delle proteine istoniche. I due processi formano un modello di regolazione flessibile ma preciso che è essenziale per le attività fisiologiche delle cellule e dei tessuti.