Il SAC, sistema di controllo nella divisione cellulare

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1 Il SAC, sistema di controllo nella divisione cellulare IFOM per la scuola Lo Studente Ricercatore 2011 Villani Yuri Liceo Scientifico Tecnologico Chimico-Biologico IIS A. Maserati - Voghera(PV) Gruppo: Biologia cellulare computazionale Tutor: Luca Mariani, Elena Chiroli

2 La scelta del lievito per lo studio Perché scegliere il lievito? Sceglierlo ha diversi vantaggi: 1) Ciclo cellulare molto veloce; 2) Facilità di mantenimento; 3) Dimensioni molto ridotte, quindi colture poco ingombranti; 4) Genoma conosciuto; 5) Facilità nel bioingegnerizzarlo; 6) Nessun problema etico. Tratto da:

3 Il ciclo cellulare Tratto da: Il ciclo cellulare comprende tutta la vita di una cellula. Alcuni passaggi sono critici per il successo della divisione. Il primo è la duplicazione del DNA in fase S(ci è utile per le analisi al FACS perché in base alla quantità di DNA capiamo qual è la fase cellulare, il secondo è la connessione microtubulicentromero in fase G2.

4 Un po' di teoria: la mitosi La mitosi è il processo che permette alla cellula singola la divisione in due cellule figlie. È una fase delicata perché qui avviene la separazione dei cromatidi fratelli, con un'alta probabilità di incorrere in errori che potrebbero portare a mutazioni nel corredo genetico. Processo schematizzato della mitosi Tratto e modificato da

5 Prima e dopo il punto critico: Tratto da: metafase e anafase Nella metafase avviene il collegamento tra i microtubuli e i centromeri. Centrosoma In anafase, i centrosomi creano una tensione sui microtubuli che fa separare e migrare nei rispettivi poli i cromatidi fratelli. T Tratto da:

6 Cos'è il SAC? Il SAC(Spindle Assembly Checkpoint) è un meccanismo che permette alla cellula di arrestare la divisione prima dell'anafase in caso di anomalie nella struttura del fuso mitotico o, in assenza di errori, fino a che tutti i microtubuli si sono uniti correttamente ai centromeri. Tratto da:

7 Perché avviene l'arresto? L'arresto in metafase avviene nel caso in cui un microtubulo non è correttamente legato al centromero. In mancanza dell'arresto, durante la migrazione dei cromatidi verso i poli, il microtubulo opposto a quello non collegato trainerebbe due cromatidi al posto di uno. Tratto e modificato da:

8 Come avviene l'arresto? La mancata connessione dei microtubuli con i centromeri, induce la formazione di un complesso con Mad2 scatenando una cascata di eventi che portano alla inibizione della separasi e al blocco del fuso mitotico impedendo così la divisione dei cromatidi in modo errato. Tratto da:

9 In laboratorio Ricreare il SAC in laboratorio ci permette di studiarlo. Come attivarlo? 2 metodi principali: Sovraespressione della proteina Mad2 grazie ad una inserzione Gal-Mad2. Distruggendo fisicamente il fuso mitotico con il nocodazolo. Noi utilizzeremo la sovraespressione di Mad2.

10 Inserzione Gal-Mad2 Il gene Gal-Mad2 viene inserito per trasformazione all'interno del corredo genetico del lievito. Permette alla cellula, in presenza di galattosio(gal), una produzione di Mad2 circa 20 volte quella naturale. Si possono fare più inserzioni(gal-mad2 1x, 2x, 3x, cioè 20, 40, 60 volte l'endogeno).

11 Primo passo: la coltura Si prepara una coltura con il ceppo che ci interessa e dopo il rilascio da alpha-factor(un ormone che ci permette di avere le cellule tutte alla stessa fase del ciclo)si tratta con sostanze diverse in base allo studio da fare e si prendono campioni ad intervalli regolari. Cellule ciclanti, prima del trattamento con alpha-factor.

12 Ceppo Gal-Mad2 in galattosio Dopo il rilascio, nella coltura si aggiunge del galattosio. Questo zucchero attiva il promotore Gal-Mad2 che sovraesprime la produzione della proteina Mad2 causando l'arresto. Cellule bloccate in metafase, si può dedurre dalla grandezza delle gemme.

13 Il FACS Il FACS è uno strumento che permette la misurazione della quantità di DNA in una cellula. Come? I campioni prelevati vanno trattati con ioduro propidio che si lega al DNA. Il propidio emana una fluorescenza letta dal FACS. In base alla quantità di fluorescenza rilevata si capisce se la cellula è in fase G1 oppure in fase G2. Se tutte le cellule di un campione sono in fase G2 vuol dire che siamo riusciti a creare un blocco efficace.

14 Leggere i dati del FACS Il FACS invia al computer collegato dei grafici che sta al ricercatore interpretare. N di cellule Quantità di DNA rilevata; fase G1 o fase G2. Se va oltre si è in presenza di cellule lisate, cioè distrutte.

15 Risultati dell'esperimento Nel caso di 3 inserzioni di Gal-Mad2 il blocco dura per oltre 7 ore.

16 In ultimo ma non meno importante Ma alla fine, cosa serve conoscere il SAC alla ricerca sul cancro? Conoscere in modo perfetto il checkpoint, ci farebbe capire come alcune cellule possano proliferare in modo anomalo, quindi cercare soluzioni più mirate in una eventuale nuova terapia.