La ricombinazione del DNA

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2 La ricombinazione del DNA Ricombinazione omologa I modelli di Halliday e di Meselson-Redding. Il complesso RecBCD genera il filamento di DNA invasore. La proteina RecA promuove lo scambio dei filamenti di DNA. Il complesso RuvABC promuove la migrazione del chiasma e la risoluzione degli intermedi di Halliday. Ricombinazione omologa sito-specifica Tre possibili risultati della ricombinazione sito-specifica. Integrazione ed escissione del batteriofago lambda.

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7 procarioti Ansa D e formazione di un DNA eteroduplex

8 Giunzione ricombinativa ha la possibilità di spostarsi in entrambi le direzioni

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11 Altri eventi di HR Appaiamento dipendente dalla sintesi (SDSA) ricombinazione omologa mitotica Appaiamento del singolo filamento su ripetizioni dirette (SSA) Replicazione indotta da Rottura (BIR) rottura del DNA con una sola estremità generalmente sui siti fragili

12 Coppia di molecole di DNA omologo (Duplex)

13 SDSA 1) Viene catturata una sola estremità 2) Il filamento di neosintesi viene spostato sul duplex che prima era danneggiato e saldato

14 1) BIR (replicazione indotta dalla rottura) 2) DSB con una sola estremità in sequenze ripetute (siti fragili) 3) Ripara il danno utilizzando una sequenza ripetuta omologa presente nel cromosoma non omologo (traslocazione non reciproca)

15 1) SSA avviene in regioni con ripetizioni dirette 2) Vengono generate code al 3. 3) I singoli filamenti si appaiano grazie all omologia delle ripetizioni 4) Processamento (rimozione) delle code

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18 Ricombinazioni Ricombinazione conservativa sito-specifica (CSSR): tra due elementi di DNA definiti Ricombinazione per trasposizione (trasposizione): tra sequenze specifiche e siti non specifici Hanno in comune le ricombinasi e la formazione del complesso sinaptico

19 La CSSR avviene tra due siti specifici o definiti di DNA La trasposizione avviene tra siti specifici e non specifici di DNA

20 CSSR: tipi e meccanismo I siti di ricombinazione sono composti da: sequenze di riconoscimento della ricombinasi e regione dello scambio Se hanno la stessa direzione (ripetizione diretta) permettono inserzione o delezione Se hanno direzione opposta (ripetizione invertita) permettono la inversione

21 CSSR (Ricombinazione conservativa sitospecifica) Il segmento di DNA che viene spostato porta i siti di ricombinazione Esempio fago l un sito di ricombinazione sul DNA fagico e l altro sul DNA batterico I siti di ricombinazione sono corti 20 bp La CSSR può dar luogo a: Inserzione in un sito specifico (es. fago l) Delezione di un pezzo di DNA Inversione di un pezzo di DNA Ogni sito di ricombinazione ha: Due sequenze di riconoscimento della ricombinasi Una sequenza centrale: regione dello scambio

22 Membri della famiglia delle integrasi Int fago lambda Cre del fago P1 FLP di lievito Recombinasi a serina o tirosina

23 Reazione tra siti specifici siti di ricombinazione non necessariamente omologhi in genere bp Esempio del fago lamba il quale si integra sul sito in loci specifici att di E. coli Escissione tra i siti alle estremità del profago lineare Il gene int del fago codifica un integrasi che catalizza la reazione di integrazione

24 Prodotti di ricombinazione sono attl ed attr attp è composto da POP elementi attb è composto da BOB elementi La sequenza centrale O è quella comune dove avviene la ricombinazione

25 Integrasi di l Il passaggio tra lo stato lisogenico e la crescita litica del fago l richiede la integrazione o escissione del DNA fagico. L integrasi l (lint, a tirosina) catalizza la ricombinazione tra i siti attp (phage) e attb (batterio) attb di 30 bp ha i due siti di legame di lint e la regione del crossing-over attp (240 bp) ha due braccia per il legame di lint e del fattore di integrazione dell ospite IHF (un fattore architettonico L escissione richiede Xis

26 In entrambi i siti attb (23 bp) ed attp (240 bp) vengono creati dei tagli sfalsati di 7bp e le estremità vengono unite in modo incrociato. La reazione genera estremità 3 -P e 5 OH L integrazione richiede il riconoscimento tra attp ed attb mentre l escissione il riconoscimento tra attl ed attr

27 Ricombinazione fago l Il ciclo del fago lambda implica che: Per essere lisogenico deve essere integrato nel DNA ospite Per entrare nel ciclo litico deve esser exciso dal cromosoma. I siti di integrazione (attp e attb) differiscono da quelli di excisione (attl e attr)

28 Meccanismo d azione

29 Ricombinasi a Tirosina Le ricombinasi a tirosina tagliano ed uniscono due filamenti, e poi gli altri due. Si ha la formazione di una Holliday junction

30 Meccanismo delle ricombinasi: Ricombinasi a Serina Una serina della ricombinasi attacca il P e libera il 3 OH. Il legame può essere riformato senza richiesta di energia (conservativo) Le ricombinasi a serina tagliano contemporaneamente i due filamenti di DNA prima dello scambio. Occorrono 4 subunità

31 Ricombinazione sitospecifica e topoisomerasi Le ricombinasi sono correlate alle topoisomerasi, e la reazione di ricombinazione somiglia quella di topoisomerasi eccetto che gli strands da duplex diversi sono uniti insieme. La reazione conserva energia usando una tyrosine catalitica nell enzima per rompere un legame fosfodiestere ed unire la terminazione al 3. due unità enzimatiche si legano al sito di ricombinazione e i due dimeri formano un complesso in cui si ha il trasferimento.

32 Cre-Lox Un sistema semplice di ricombinasi a tirosina si trova nel batteriofago P1. La Cre recombinase codificata dal fago catalizza la ricombinazione tra due sequenze bersaglio. Le sequenze ricombinanti del fago P1 sono identiche, sono di 34 bpchiamati loxp. La Cre ricombinase è sufficiente per la reazione; nessuna proteina accessoria è richiesta Per la sua semplicità ed efficienza, il sistema Cre/lox è stato adattato per le cellule eucariote, dove è diventata una tecnica standard per site-specific recombination Struttura di Cre

33 Cre-lox Ogni subunità di Cre si lega alla sequenza di riconoscimento. Si ha un tetramero sul DNA cruciforme Cre ha due conformazioni quella verde può tagliare il DNA. Cambiando la coppia di subunità attive si taglia anche il secondo filamento

34 Ricombinasi Hin inverte il DNA Nella Salmonella la ricombinasi Hin inverte una regione di 1000 bp fiancheggita da siti invertiti hixl e hixr In una posizione il promotore attiva i geni per la flagellina 2 e repressore per flagellina 1 Nell altra induce flagellina 1 Il sistema necessita di un enhancer a DNA che lega la proteina Fis

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36 DNA mobile La seconda classe di DNA, interspersed DNA (moderately repeated DNA, Intermediate-repeat DNA). Fatta da un gran numero di poche famiglie di sequenze (45% hu genoma) Elementi mobili di DNA o elementi transposabili. Divisi in due categorie: DNA transposons e retrotransposons

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38 Genoma e ed evoluzione

39 Genoma e ed evoluzione Sequenze regolative Regioni intergeniche uniche Pseudogeni Relitti? Non espressi? DNA microsatellite 3% Regioni intergeniche ripetute DNA altamente ripetuto 45%

40 Tendenzialmente all aumentare della complessità di un organismo, decresce la densità genica ed aumentano le sequenze ripetute.

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43 Genoma

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46 La trasposizione Elementi trasponibili o trasposoni. Il movimento avviene per un ricombinazione tra le estremità dell elemento trasponibile e una sequenza di DNA della cellula. Tre classi Trasposoni a DNA Retrotrasposoni simili ai virus Retrotrasposoni poli-a

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48 Trasposoni Ciascuno contiene un gene o più geni necessari per la propria mobilità A volte necessitano di una DNA polimerasi o girasi o altri enzimi per trasporre

49 Due tipi A DNA classe I (procarioti ed eucarioti) Ad RNA classe II (eucarioti)

50 Struttura di un trasposone procarioti IS 1) Una sequenza che codifica l enzima trasposasi o altri enzimi fiancheggiata da brevi ripetizioni terminali invertite 2) chiamata sequenza d inserzione 3) Il sito bersaglio viene duplicato durante l inserzione formando ripetizioni dirette 5-10 bp caratteristica per ogni IS all estremità del trasposone

51 Struttura di un trasposone 1) Il tasso di trasposizione è variabile ed è di circa 1 ogni diecimila elemento per generazione

52 Trasposoni a DNA: taglia e Il DNA con ripetizioni invertite viene escisso, Il complesso sinaptico o trasposoma Nel DNA bersaglio viene fatta una nick, e si ha una trans-esterificazione: trasferimento del filamento di DNA. incolla

53 Fig Organizational maps of bacterial plasmids with transposable elements

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55 IS e Tn nei procarioti

56 Esempio di DNA transposons: Bacterial Insertion Sequences (IS elements) 1-2 kb. La parte centrale codifica una transposase

57 Modello di trasposizione di IS batteriche Caratteristiche: Inverted repeats (50 b) Direct repeats (5-11 b)

58 Trasposoni a DNA

59 meccanismo

60 Il transposoma La transposasi è codificata dal transposone Occorrono almeno 2 subunità Ha il ruolo di riconoscere le estremità, unirle, tagliarle per fare il transposoma, ed inserire nel DNA bersaglio

61 La transposizione a DNA con meccanismo replicativo Dopo il trasferimento del filamento si forma una struttura con due ramificazioni, che può fungere da forca replicativa. La replicazione termina sulla seconda forca e produce due copie del transposone animazione

62 Trasposizione replicativa Repliconi donatore e ricevente Cointegrato contiene 2 copie del trasposone La HR tra le copie del trasposone rigenera due repliconi originali contenente ciascuna copia del trasposone

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64 Non-replicativa

65 Tn5

66 Meccanismi di taglio del filamento non trasferito

67 1) La HR tra copie multiple di un trasposone causa riarrangiamenti del DNA ospite 2) La HR tra le ripetizioni di un trasposone può essere precisa o imprecisa

68 Disgenesi dell ibrido in drosophila 1) elementi P portati dai ceppi P ma non M 2) l icrocio tra un maschio P e femmina M attiva la trasposizione inattivando geni della fertilità

69 1) Gli elementi P vengono attivati nella linea germinale da uno splicing alternativo generando una trasposasi la quale lega sequenze di 10 bp adiacenti alle ripetizioni invertite avviando una trasposizione di tipo non replicativo tipica degli eucarioti. 2) l elemento P produce un repressore della trasposizione ereditato per via materna

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71 Retrotrasposoni (elementi di classe I o retroelementi) Coinvolge un intermedio ad RNA limitata agli eucarioti Correlati ai provirus retrovirali nell oraganizzazione e trasposizione chiamati (retrotrasposoni LTR) Retrotrasposoni o Retroposoni non-ltr o poli-a utilizzano un sistema di trasposizione caratteristico

72 1) RNA a singola elica 2) Duplica il genoma RNA attraverso un intermedi a DNA 3) Trascrittasi inversa

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75 Hanno un RNA intermedio Il promotore è su LTR ed l RNA viene copiato in cdna Un integrasi riconosce le estremità e dirige il trasposoma al bersaglio. Una trascrittasi inversa sintetizza il DNA

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78 RNA virale termina con ripetizioni dirette R (10-80 bp) 5 RU5 e 3 U3R. I segmenti R sono usati x generare ripetizioni dirette + estese nel DNA lineare Accorciamento di 2 bp a ciascuna estremità nella forma integrata Dopo l integrazione l estremità 3 di U5 e 5 di U3 è formata da brevi ripetizioni invertite

79 Trascrittasi inversa ha un attività di DNA polimerasi RNAsi H trna innesco a bp dal 5 Salto intramolecolare o intermolecolare Ha come risultato si ha l estensione dei segmenti terminali formando LTR

80 Scelta della copia scambio di filamenti stampo durante la sintesi del DNA. La sintesi del filamento + necessita di un secondo salto

81 Modello dell retrotrascrizione di RNA retrovirale genomico in DNA

82 Scelta della copia è un meccanismo ricombinativo derivata da uno scambio nei filamenti stampo

83 Il DNA lineare a doppia elica viene inserito nel DNA dell ospite da un integrasi retrovirale Si ha la perdita di 2 bp all estremità del DNA virale La reazione è catalizzata da un integrasi L estremità LTR dei retrovirus e trasposoni virali è formata da un dinucleotide CA che è conservata e caratteristica L integrasi genera tagli sfalsati sul sito bersaglio separati da 4-6 bp. Il provirus è fiancheggiato da brevi ripetizioni dirette del sito bersaglio

84 Retroelementi si dividono in tre classi hanno i meccanismi di TI Retrotrasposoni LTR Retrotrasposoninon-LTR SINE Tipi comuni Ty (lievito) e copia (drosophila) L1 (uomo) B1,B2, ID,B4 (topo) SINE (mammifero) Pseudogeni di trascritti di Pol III Terminazioni LTR Nessuna ripetizione Nessuna ripetizione Ripetizioni nel bersaglio 4-6 bp 7-21 bp 7-21 bp Attività Enzimatiche TI e/o integrasi TI e/o endonucleasi Nessuna Organizzazione possono contenere introni Uno o due ORF non interrotti Nessun introne

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87 LTR retrotransposons Alcuni contengono long terminal repeats (LTR, bp) Codificano le proteine tipiche dei retrovirus, eccetto quelle dell envelope. Codificano reverse transcriptase e integrase Nell uomo la maggior parte deriva dal retrovirus endogeno ERV

88 Fig The Ty transposable element of yeast Nel lievito 5 elementi Ty conosciuti (Ty1-5) La classe Ty1/copia è quello + comune rispetto a Ty3/gypsy Ty1 contiene 5bp del DNA bersaglio terminale caratteristic Frequenza di ricombinazione + bassa rispetto ai procarioti Hanno un meccanismo di trasposizione simile ai retrovirus TyA TyB

89 Copia è un retrotrasposone LTR tipico di D. melanogaster Sono molto simili tra loro ed abbondanti varia in base al ceppo Hanno un sistema di trasposizione simile a Ty di lievito

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94 Costituiscono metà del genoma umano

95 Retrotrasposoni senza LTR Chiamati anche retrotransposoni non virali. Formano due classi: Long interspersed elements (LINE) (6 kb), promuovono la loro mobilità e forniscono le proteine per la mobilità di SINE Short interspersed elements (SINE) (300 bp) Hanno sequenze simili ai geni: un promotore e polia. Spesso si presentano come pseudogeni processati, senza il 5

96 LINE Tre maggiori famiglie: L1, L2 ed L3 L1 è la più abbondante (21% DNA totale) Codifica: RNA-binding protein (ORF1) e rev transcriptase/dna endonuclease (ORF2).

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100 SINE 13% DNA umano bp. Non codificano proteine. Hanno una sequenza ricca in A/T, come LINE. 1.6 milioni di siti, di cui 1.1 sono elementi Alu

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103 Exon shuffling per ricombinazione tra interspersed repeats omologhi

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110 Pseudo geni come punti di partenza per esplorare nuove proteine Il modello classico per spiegare l origine di nuove strutture proteiche prevede che da un gene si possano originare delle copie così mentre una copia mantiene la funzione originale, l altra è libera di accumulare mutazioni e poter evolvere. Naturalmente la copia di un gene potrebbe subire vari destini: perdere funzionalità e diventare uno pseudo-gene, rimanere immutata e quindi costituire la ridondanza del gene originale oppure evolvere verso nuove e più complesse funzioni. Gli pseudo-geni si dividono in processati e non processati. Quelli processati si trovano su diversi cromosomi rispetto alla copia originale, non hanno introni, terminano spesso con delle adenine, sono fiancheggiati da ripetizioni e si trovano solo nei mammiferi. Quelli non processati, si trovano sullo stesso cromosoma del gene originale, hanno introni, hanno delle mutazioni che fanno comparire dei codoni di STOP prematuri o eliminare codone di inizio della traduzione originale, possono produrre un mrna tronco o intero e si possono trovare in varie specie. Un esempio di nuovi geni funzionali evoluti da un gene originale è quello dell emoglobina umana, infatti ne esistono varie copie ma espresse in diversi stadi dello sviluppo.

111 In bocca al Lupo

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