Tipi di ricombinazione

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1 Tipi di ricombinazione Omologa tra sequenze molto simili (durante la meiosi) Sito-Specifica tra sequenze con limitata similarità. Coinvolge siti specifici Transposizione movimento di elementi di DNA da un sito ad un altro (trasposoni)

2 Ruolo biologico della ricombinazione 1. Generare nuove combinazioni geniche o alleliche (crossing over durante la meiosi) 2. Generare nuovi geni (riarrangiamento nell produzione di immunoglobuline) 3. Integrazione di elementi di DNA 4. Riparo del DNA Utilità pratiche Mappatura dei geni sul cromosoma Generazione di organismi transgenici

3 Ricombinazione negli eucarioti

4 Crossing-over

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6 Modello di scambio dei filamenti secondo Holliday

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8 1 sito 2 sito

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10 Ricombinazione indotta da tagli a doppia elica

11 Ricombinazione indotta da tagli a doppia elica

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13 RecA: forma attiva filamento nucleoproteico (100 subunità di ReaA e 300 nucleotidi ) (Aumento della lunghezza del DNA legato a RecA)

14 Ricerca della complementarità

15 Appaiamento delle basi complementari (+/- 15coppie di basi)

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19 RuvB ATPasi esamerica

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22 La ricombinazione del DNA Ricombinazione omologa I modelli di Holliday e di Meselson-Redding. Il complesso RecBCD genera il filamento di DNA invasore. La proteina RecA promuove lo scambio dei filamenti di DNA. Il complesso RuvABC promuove la migrazione del chiasma e la risoluzione degli intermedi di Holliday.

23 Trasposoni

24 I TRASPOSONI I trasposoni sono elementi mobili che si trovano nel genoma di tutti gli organismi. Sono in grado, con meccanismi diversi, di saltare da un punto all altro del genoma. Questi salti possono determinare drastici cambiamenti nella struttura e nelle modalità di espressione dei geni. Appartengono a diverse classi, accomunate dalla caratteristica di avere la sequenza trasposta fiancheggiata da corte sequenze ripetute generate dalla duplicazione di una sequenza nel sito bersaglio (Ripetizione intersperse o IR) Sotto certi aspetti possono essere considerati come elementi parassitari, e in effetti alcuni di essi sono imparentati con particolari famiglie di virus (retrovirus). Tuttavia rappresentano un formidabile fattore positivo per i processi evolutivi. La trasposizione è un fenomeno diverso dalla ricombinazione omologa ed è chiamata ricombinazione non-omologa. I trasposoni possono causare mutazioni geniche e mutazioni cromosomiche Hanno un ruolo importante nell evoluzione dei genomi

25 Elementi trasponibili Sequenze che hanno la capacità di muoversi da un sito all altro del cromosoma sito donatore sito accettore Diversamente dagli altri processi coinvolti nella ricombinazione genomica, per la trasposizione non c è nessuna omologia tra le sequenze del sito donatore e accettore

26 Ripetizioni intersperse Trasposoni a DNA si originano attraverso un intermedio a DNA, secondo meccanismo di trasposizione conservativa o replicativa Retrotrasposoni si originano per eventi di retrotrasposizione, attraverso un intermedio ad RNA elementi LTR LINEs: long interspersed nuclear elements SINEs: short interspersed nuclear elements

27 Trasposoni a DNA

28 I trasposoni a DNA Codificano e utilizzano l enzima trasposasi (capace di tagliare e riunire il DNA in corrsispondenza di ripetizioni terminali invertite o sequenze di insersione) trasposasi L enzima trasposasi ha due diversi domini funzionali: un dominio catalitico che catalizza le reazioni necessarie per la trasposizione del DNA, l idrolisi dei legami fosfodiestere e una reazione di inserzione del trasposone nel nuovo sito un dominio che lega il DNA

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30 I Trasposoni a DNA possono essere distinti in due categorie: Trasposoni a DNA che si spostano replicandosi: una copia rimane nel sito originale, mentre la nuova copia si inserisce altrove nel genoma Trasposoni a DNA che si spostano in maniera conservativa, da un sito all altro del genoma senza aumentare il numero di copie.

31 Retrotrasposoni

32 Trasposoni che si muovono indirettamente (retrovirus endogeni) IR LTR LTR IR Proteasi Integrasi RT RNAsi-H mrna cdna Integrazione Gli pseudogeni che si ritrovano nel genoma umano sono spesso derivati da eventi di retrotrasposizione

33 LINEs:long interspersed nuclear elements promotore Pol II RNA binding anche endonucleasi ripetizioni dirette Gli elementi LINEs o trasposoni non-ltr hanno una lunghezza di circa 6-7kb, contengono una o due ORF e un segnale di poliadenilazione all estremità 3. Le LINEs si inseriscono preferibilmente nelle regioni eucromatiche ricche in A+T. Le copie attive inserendosi in punti critici del genoma possono inattivare dei geni con conseguente insorgenza di patologie.

34 Trasposizione degli elementi LINE Trascrizione inversa innescata dal sito bersaglio citosol

35 SINEs: short interspersed nuclear elements A B AAAA SINE Gli elementi SINEs sono elementi non-autonomi, hanno una lunghezza compresa tra 0.1 e 0.4 kb. Hanno una regione ricca in A all estremità 3 ma non contengono un segnale di poliadenilazione. Gli elementi SINEs non contengono alcuna ORF codificante per una trascrittasi inversa, ma sono in grado di trasporre utilizzando la trascrittasi inversa sintetizzata da altri retroelementi (trasposizione LINEs-dipendente).

36 SINEs: short interspersed nuclear elements Gli elementi SINEs sono distribuiti ad alta densità nelle regioni ricche in CG del genoma Nel genoma dei primati sono presenti tre differenti famiglie di elementi SINEs: l elemento Alu, ancora attivo, e gli elementi inattivi MIR e Ther2/MIR3. L elemento Alu, il più comune nei primati, è lungo 0,3kb; è presente in circa di copie nel genoma umano e rappresenta quindi oltre il 10% di tutto il genoma. Presenta una regione ricca in A/T all estremità 3, coinvolta nel meccanismo di retrotrasposizione. Le sequenze Alu sono localizzate a monte o a valle dei geni, negli introni, nelle regioni 5 e 3 non tradotte dell mrna. Non è noto il loro ruolo funzionale, nonostante siano molto diffuse nel genoma di tutti i primati.

37 EFFETTO DEI TRASPOSONI

38 Che cosa possono fare i trasposoni saltando nel genoma? MUTAZIONE INSERZIONALE Inserzione nella sequenza codificante (o nelle sequenze di controllo) con inattivazione totale o parziale del gene. Trasposone A B C D E F A B C D E F * Per questa proprietà, i trasposoni sono molto utilizzati per mutagenizzare e successivamante identificare i geni responsabili di particolari fenotipi. Un organismo che si presta molto bene a questo è Drosophila Melanogaster.

39 Inattivazione del gene bersaglio trasposone promotore DNA mrna proteina assente o tronca

40 Nel caso di trasposizione in un operone si osserva un effetto polare P gene 1 gene 2 gene 3 mrna policistronico P Anche i geni 2 e 3 non vengono espressi in quanto la trascrizione è bloccata dall elemento trasponibile

41 Che cosa possono fare i trasposoni saltando nel genoma? Attivazione trascrizionale del gene LTR LTR Retroposone A B C D E F promotore forte LTR A B C D E F Elementi trasponibili hanno spesso promotori direzionati verso l esterno

42 Che cosa possono fare i trasposoni saltando nel genoma? Produzione di nuove varianti alternative di una proteina Trasposone Promotore A B C D E F A B C D E F

43 Genoma nucleare umano (Nature, 431: , 2005) (da: Molecular Biololgy of the Cell, Fig. 4.17) La porzione codificante rappresenta l 1-2% del genoma (geni codificanti per proteine, trna e rrna. La porzione non-codificante è costituita da sequenze uniche e sequenze ripetute. Queste si suddividono in: 1) ripetizioni intersperse LINEs, SINEs, LTR, trasposoni a DNA); e 2) ripetizioni in tandem (blocchi ripetuti in tandem dei centromeri e dei telomeri, micro- e mini-microsatelliti, duplicazioni segmentali). La distribuzione degli elementi ripetuti varia trai i cromosomi, con alcuni 43 cromosomi che contengono anche il 90% di DNA non codificante

44 Elementi trasponibili nell uomo

45 Insersione di un elemento trasponibile nel gene che codifica per l antocianina

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