Caratteristiche generali

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1 La trasposizione

2 Caratteristiche generali Gli elementi genetici trasponibili sono frammenti di DNA che hanno la capacità di spostarsi all interno di una singola cellula da una posizione all altra del cromosoma o dal cromosoma ad un elemento extracromosomico come un plasmide e viceversa. Questo processo di spostamento del DNA da un punto a un altro del genoma prende il nome di Trasposizione e avviene con un meccanismo di ricombinazione sito-specifica in corrispondenza di un sito definito: SITO DI TRASPOSIZIONE. I principali elementi genetici trasponibili sono: 1) le Sequenze di Inserzione; 2) i Trasposoni e 3) gli Integroni.

3 Gli elementi genetici trasponibili sono presenti sia nei genomi dei procarioti che degli eucarioti. In particolare nei procarioti essi possono spostarsi in posizioni nuove nel medesimo cromosoma, oppure su elementi extracromosomici: plasmidi o fagi. Negli eucarioti essi possono spostarsi sia in posizioni diverse sullo stesso cromosoma sia su cromosomi differenti. La trasposizione richiede la presenza di siti per la trasposizione e ricombinazione del DNA, sia sul trasposone che sul DNA bersaglio, e richiede l'azione di specifici enzimi detti Trasposasi.

4 Barbara McClintock e la scoperta dei Trasposoni La diversa colorazione delle cariossidi di questa spiga di mais è il risultato dell'azione dei trasposoni.

5 Barbara McClintock e la scoperta dei Trasposoni La biologa americana Barbara McClintock si dedicò allo studio dei trasposoni negli anni 40 e 50; Nei suoi esperimenti iniziali, concentrò la sua attenzione su quelle cariossidi che, invece di presentare una colorazione uniforme erano caratterizzate dalla presenza di macchie di colore diverso su una base incolore. A quel tempo si sapeva che i geni del mais potevano presentare due forme diverse (alleli): uno, chiamato C, responsabile della colorazione viola, e il suo mutante, chiamato c, a cui si doveva la cariosside incolore (localizzati sul cromosoma 9). La McClintock scoprì che la colorazione a macchie delle cariossidi era legata al fatto che, in alcuni casi l'allele mutato c (incolore) poteva revertire nel suo allele originario C (colore) originando la macchia. Scoprì inoltre, che, questa mutazione, era causata da un "elemento mobile" che, se presente nel gene C, ne causa la mutazione in c (rendendolo, in pratica, incapace di produrre il pigmento colorato) e che, durante lo sviluppo della cariosside, da questi poteva essere trasposto revertendo c in C e rendendolo così nuovamente capace di produrre il pigmento.

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7 L activator Ac codifica per una transposasi che agisce su Ac stesso e sul dissociatore determinando lo spostamento delle due sequenze ed il fenotipo a macchie delle cariossidi del mais

8 La trasposizione è un processo che può avere conseguenze Funzionali: In seguito alla trasposizione si può avere l'inattivazione funzionale di un gene, nel caso in cui il Trasposone si inserisca nella regione codificante del gene; Si può verificare una modificazione dei livelli di espressione di un gene, nel caso in cui il Trasposone si inserisca in elementi regolatori (Sequenze Promotore e/o Operatori); Può attivare geni vicini agendo sull inizio della trascrizione, ovvero agendo come interruttore per i geni adiacenti per effetto di ricombinazione reversibile tra le sequenze ripetute ed invertite; Può portare all acquisizione di nuove caratteristiche fenotipiche come la resistenza ad un farmaco antibatterico.

9 I trasposoni procariotici, contengono tutti i geni necessari alla mobilizzazione: ovvero che codificano per le proteine coinvolte nell escissione dal genoma e nell integrazione dell elemento genetico mobile In più, contengono anche dei geni aggiuntivi con funzioni accessorie: resistenza agli antibiotici e capacità di sintetizzare una particolare molecola. I trasposoni batterici appartengono a diverse classi: 1)Trasposoni semplici o Sequenze d inserzione ( bp) 2) Trasposoni composti o complessi ( bp) 3) Trasposoni di classe III che sono retrotrasposoni e fagi

10 SEQUENZE DI INSERZIONE Il genoma batterico contiene diversi Elementi trasponibili, capaci di mobilizzarsi nel cromosoma.. Le Sequenze di Inserzione sono elementi mobili semplici indicate solitamente da un numero preceduto dal prefisso IS. Codificano solo per le funzioni coinvolte nella loro mobilizzazione: Contengono il gene per la Trasposasi. Presentano elementi in cis attivi nel processo di ricombinazione denominati Elementi di Terminazione disposti all estremità dell elemento. La trasposasi è in grado di riconoscere e processare gli elementi di terminazione. Il gene per la trasposasi occupa quasi l intera lunghezza dell elemento IS.

11 IR: SEQUENZE RIPETUTE ED INVERTITE Ogni elemento di terminazione è costituito da sequenze di DNA ripetute ed invertite dette IR, di dimensioni comprese tra 10 e 40 bp. Le due copie delle ripetizioni sono identiche e fiancheggiano le estremità delle IS ma con orientamento opposto: IRL a sinistra e IRR a destra. Le IR hanno due domini funzionali uno più interno coinvolto nel legame con la Trasposasi L altro più esterno di 2 o 3 bp coinvolto nell escissione dell elemento trasponibile. Il promotore per la Trasposasi è localizzato a monte nella IRL.

12 Promotore della trasposasi IRL Dominio di legame della trasposasi IRR Dominio di legame della trasposasi

13 DR: SEQUENZE RIPETUTE DIRETTE Le IS sono anche caratterizzate dalla presenza di Ripetizioni Dirette DR fiancheggianti il sito bersaglio, generate in seguito all evento di inserzione. Tali ripetizioni sono il risultato della modalità con la quale si verifica il legame della Trasposasi al sito bersaglio, mediante la formazione di un taglio sfalsato. Le sequenze DR variano ad ogni evento di trasposizione ma la lunghezza è costante per ogni elemento IS ed è compresa tra 2 e 14bp La lunghezza più frequente delle DR è 9bp.

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16 Struttura del Dominio della Trasposasi Le ripetizioni invertite definiscono, dunque i due estremi dell elemento trasponibile. Il loro riconoscimento è un passaggio comune a tutti gli eventi di trasposizione per azione della Trasposasi. Le regioni specifiche con attività di legame al DNA della Trasposasi sono di solito localizzate nella porzione N-terminale. Il sito catalitico è localizzato nella porzione C-terminale. Tale disposizione permette l interazione della molecola di Trasposasi neo-sintetizzata con le sequenze bersaglio, determinando accoppiamento tra Traduzione e attività Traspositiva.

17 Relazione tra trascrizione e attività di trasposizione Esistono numerose evidenze che la localizzazione dei trasposoni in regioni genomiche attivamente trascritte ne riduca l attività traspositiva. La Trasposasi, infatti, in tali regioni lega a bassa affinità la IRL e quindi la frequenza di trasposizione diminuisce. Analogamente, in alcuni trasposoni, l attività dei promotori interni orientati in direzione opposta rispetto al gene della trasposasi ne riduce la mobilizzazione. Probabilmente ciò accade poiché durante la trascrizione regioni del DNA del trasposone critiche per il riconoscimento della Trasposasi sono sequestrate.

18 I trasposoni compositi, sono identificati con il suffisso Tn come ad esempio Tn10; I trasposoni complessi o composti Sono costituiti da una parte centrale, contenente diversi geni, e da due laterali costituite da sequenze di inserzione IS; Le IS a loro volta presentano sequenze ripetute ed invertite di diverse coppie di basi alle estremità. La trasposizione dei trasposoni compositi è resa possibile proprio da tali elementi, che possono avere lo stesso orientamento ma talvolta anche orientamento opposto.

19 In un trasposone complesso la porzione centrale è fiancheggiata da IS che codificano per le funzioni di trasposizione: trasposasi e Integrasi necessarie per lo spostamento. Il processo di trasferimento richiede il riconoscimento di ripetizioni invertite degli elementi IS alle estremità del trasposone.

20 I trasposoni sia composti che semplici hanno caratteristiche strutturali differenti, ad esempio: a) Tn10: gli elementi IS hanno orientamento opposto e formano ripetizioni invertite (IR). La trasposasi è codificata da uno degli elementi IS. b) Tn3: le brevi ripetizioni IR non codificano per la trasposasi, ma è il trasposone stesso che svolge tale funzione. I trasposoni procariotici furono inizialmente scoperti come elementi genetici mobili che conferiscono resistenza ai farmaci. Molti elementi mobili sono formati infatti da elementi IS riconoscibili che fiancheggiano un gene che codifica per la resistenza ai farmaci, spesso inseriti in elementi extracromosomici come i plasmidi.

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22 Mappa schematica di un plasmide che porta trasposoni semplici e trasposoni composti contenenti geni per la resistenza a farmaci Spesso i trasposoni possono fondersi tra di loro formando elementi genetici trasponibili codificanti tanti e diversi determinanti di resistenza antibiotica.

23 Trasposizione e Coniugazione Alcuni elementi genetici prendono il nome di Trasposoni Coniugativi perché presentano oltre ai geni per la trasposizione intramolecolare i geni che permettono il loro trasferimento per coniugazione batterica da una cellula ad un altra. I trasposoni coniugativi NON presentano elementi IS all estremità ma solo delle sequenze invertite-ripetute IR riconosciute dalle ricombinasi sito-specifiche che catalizzano la trasposizione. Un esempio ben studiato di Trasposone Coniugativo è rappresentato dal Tn916 di Enterococcus faecalis. Anche se Tn916 non è in grado di replicarsi autonomamente, può trasferirsi da E. faecalis ad un gran numero di organismi riceventi ed integrarsi all'interno dei loro cromosomi. Essendo provvisto di un gene per la resistenza alla tetraciclina, anche questo trasposone coniugativo diffonde la farmaco-resistenza.

24 Esempio di Distribuzione degli elementi IS in un plasmide coniugativo F I plasmidi sia coniugativi che non possono contenere numerosi e vari siti bersaglio dei trasposoni. Di conseguenza, i trasposoni migrano frequentemente tra i plasmidi.

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28 Significato evolutivo dei trasposoni L'evoluzione dei trasposoni e l'effetto che questi hanno nel genoma degli organismi superiori e batterico è un campo di studi ancora aperto e oggetto di numerose discussioni. I trasposoni sono stati scoperti in organismi viventi appartenenti ai phyla più diversi. Sebbene i trasposoni possano, a volte, conferire dei vantaggi ai loro organismi ospiti, vengono comunque generalmente considerati come elementi autonomi di DNA parassita, capaci di esistere all'interno del genoma di una cellula. Sotto questo aspetto, possono essere considerati affini ai virus. Virus e trasposoni condividono inoltre diversi aspetti nella composizione del genoma e nelle capacità biochimiche il che, ha portato, molti scienziati, ad avanzare l'ipotesi che possano derivare da un progenitore comune.

29 Significato evolutivo dei trasposoni Poiché attività di trasposizione troppo elevata può destabilizzare il genoma e uccidere la cellula, molti organismi, hanno sviluppato diversi meccanismi per poter ridurre la trasposizione a livelli accettabili. I batteri, possono sopportare delezioni anche piuttosto estese, per rimuovere trasposoni e DNA virali dai loro genomi, Mentre gli eucarioti potrebbero aver evoluto il meccanismo della interferenza a RNA anche come un modo per ridurre l'attività di trasposizione: è stato infatti dimostrato che, nel nematode Caenorhabditis elegans, alcuni geni necessari per l'interferenza a RNA, permettono la riduzione dell'attività dei trasposoni.

30 Applicazioni della Trasposizione Le numerose proprietà dei trasposoni li hanno resi strumenti indispensabili per gli studi genetici e per la manipolazione genetica. Dopo l inserzione i trasposoni sono infatti stabili e possono inattivare o attivare un gene. Sono facilmente selezionabili per la farmaco resistenza. Possono essere impiegati per produrre mutazioni ad alta frequenza all interno di una cellula e mutagenesi localizzata. Possono essere prodotte sonde per un trasposone per lo screening di librerie genomiche.

31 Meccanismi di trasposizione Durante un qualsiasi evento di trasposizione la trasposasi riconosce la sequenza del sito bersaglio e produce un taglio a singolo filamento; Il trasposone subisce anch esso dei tagli e si inserisce nella sequenza bersaglio dove il DNA viene risaldato con conseguente duplicazione della sequenza bersaglio Esistono diversi modelli per spiegare i meccanismi di trasposizione nelle cellule procariotiche I più accreditati sono il modello Replicativo, quello Non- Replicativo e Conservativo.

32 TRASPOSIZIONE CONSERVATIVA Nella Trasposizione Conservativa, il trasposone viene perso dalla sede originaria e acquisito in una nuova sede bersaglio. Questo evento di trasposizione prevede il taglio netto delle estremità del trasposone e un taglio netto nel DNA ricevente. Il Trasposone viene così integrato senza formare ripetizioni fiancheggianti dirette (evento Molto Raro).