Parte I I principi fondamentali della clonazione dei geni e dell analisi del DNA

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1 6746 BROWN Iniziali I-XIV :57 Pagina VII Indice Parte I I principi fondamentali della clonazione dei geni e dell analisi del DNA Capitolo 1 L importanza della clonazione dei geni e dell analisi del DNA Le prime fasi dello sviluppo della genetica L avvento della clonazione dei geni e della reazione a catena della polimerasi Che cos è la clonazione dei geni? Che cos è la PCR? Perché la clonazione dei geni e la PCR sono così importanti? Isolamento dei geni mediante clonazione Isolamento dei geni mediante PCR In che modo orientarsi in questo libro 11 Letture ulteriori 12 Capitolo 2 Vettori per la clonazione dei geni: plasmidi e batteriofagi I plasmidi Caratteristiche fondamentali dei plasmidi Dimensioni e numero di copie Coniugazione e compatibilità Classificazione dei plasmidi Plasmidi di organismi diversi dai batteri I batteriofagi Le caratteristiche fondamentali dei batteriofagi I fagi lisogeni I virus come vettori di clonaggio in altri organismi 26 Letture ulteriori 26 Capitolo 3 Purificazione di DNA da cellule vive Preparazione di DNA cellulare totale Crescita e raccolta di una coltura batterica Preparazione di un estratto cellulare Purificazione del DNA da un estratto cellulare Concentrazione dei campioni di DNA 35

2 6746 BROWN Iniziali I-XIV :57 Pagina VIII VIII Indice Misurazione della concentrazione del DNA Altri metodi di preparazione di DNA cellulare totale Preparazione di DNA plasmidico Separazione in base alle dimensioni Separazione in base alla conformazione Amplificazione del plasmide Preparazione del DNA di batteriofago Crescita delle colture per ottenere un alto titolo di Preparazione di fagi non lisogeni Raccolta dei fagi da una coltura infettata Purificazione del DNA da particelle di fago La purificazione del DNA di M13 pone pochi problemi 49 Letture ulteriori 51 Capitolo 4 Manipolazione di DNA purificato La gamma degli enzimi di manipolazione del DNA Nucleasi Ligasi Polimerasi Enzimi di modificazione del DNA Topoisomerasi Gli enzimi che tagliano il DNA le endonucleasi di restrizione La scoperta e la funzione delle endonucleasi di restrizione Le endonucleasi di restrizione di tipo II tagliano il DNA a livello di sequenze nucleotidiche specifiche Estremità nette ed estremità coesive La frequenza delle sequenze di riconoscimento in una molecola di DNA Esecuzione di una digestione di restrizione in laboratorio Analisi del risultato del taglio delle endonucleasi di restrizione Stima delle dimensioni delle molecole di DNA Mappatura delle posizioni di siti di restrizione diversi in una molecola di DNA La legatura l unione di molecole di DNA Il meccanismo di azione della DNA ligasi Le estremità coesive fanno aumentare l efficienza della legatura Aggiunta di estremità coesive a una molecola a estremità nette 75 Letture ulteriori 81 Capitolo 5 Introduzione di DNA in cellule vive Trasformazione l assunzione di DNA da parte di cellule batteriche Non tutte le specie batteriche assumono DNA con la stessa efficienza Preparazione di cellule competenti di E. coli Selezione delle cellule trasformate Identificazione dei ricombinanti Selezione dei ricombinanti con pbr322 inattivazione inserzionale di un gene della resistenza a un antibiotico L inattivazione inserzionale non riguarda sempre la resistenza agli antibiotici 90

3 6746 BROWN Iniziali I-XIV :57 Pagina IX Indice IX 5.3 Introduzione di DNA fagico in cellule batteriche Trasfezione Packaging in vitro di vettori di clonaggio L infezione fagica si visualizza sotto forma di placche su un mezzo di agar Identificazione di fagi ricombinanti Inattivazione inserzionale di un gene lacz portato dal vettore fagico Inattivazione inserzionale del gene ci di Selezione mediante utilizzo del fenotipo Spi Selezione in base alle dimensioni del genoma di Introduzione di DNA in cellule non batteriche Trasformazione di singole cellule Trasformazione di interi organismi 99 Letture ulteriori 100 Capitolo 6 Vettori di clonaggio per E. coli Vettori di clonaggio basati su plasmidi di E. coli La nomenclatura dei vettori di clonaggio plasmidici Le proprietà utili di pbr Il pedigree di pbr Vettori di clonaggio plasmidici di E. coli più sofisticati Vettori di clonaggio basati sul batteriofago M Sviluppo dei vettori di clonaggio M Vettori ibridi plasmide-m Vettori di clonaggio basati sul batteriofago Segmenti del genoma di possono essere deleti senza alterarne la vitalità Si può usare la selezione naturale per isolare modificato privo di certi siti di restrizione Vettori di inserzione e di sostituzione Esperimenti di clonazione con vettori di inserzione o di sostituzione Usando un cosmide si possono clonare lunghi frammenti di DNA I vettori e altri vettori ad alta capacità permettono la costruzione di librerie genomiche Vettori per altri batteri 123 Letture ulteriori 123 Capitolo 7 Vettori di clonaggio per gli eucarioti Vettori per lievito e altri funghi Marcatori selezionabili per il plasmide da 2 m Vettori basati sul plasmide da 2 m plasmidi episomici di lievito Uno YEp si può inserire nel DNA cromosomico del lievito Altri tipi di vettori di clonaggio di lievito I cromosomi artificiali possono essere usati per clonare lunghi frammenti di DNA nel lievito Vettori per altri lieviti e per i funghi Vettori di clonaggio per le piante superiori Agrobacterium tumefaciens l ingegnere genetico più piccolo esistente in natura 133

4 6746 BROWN Iniziali I-XIV :57 Pagina X X Indice Clonazione di geni nelle piante mediante trasferimento genico diretto I tentativi di usare virus vegetali come vettori di clonaggio Vettori di clonaggio per gli animali Vettori di clonaggio per gli insetti La clonazione nei mammiferi 144 Letture ulteriori 147 Capitolo 8 Il modo in cui si ottiene un clone di un gene specifico Il problema della selezione Esistono due strategie fondamentali per ottenere il clone desiderato Selezione diretta La sopravvivenza dovuta al marcatore estende le applicazioni della selezione diretta Gli scopi e le limitazioni della sopravvivenza dovuta al marcatore Identificazione di un clone in una libreria di geni Librerie di geni Non tutti i geni sono espressi contemporaneamente L mrna può essere clonato come DNA complementare Metodi per identificare il clone I filamenti complementari di acido nucleico ibridano fra loro Sondaggio di colonie e placche mediante ibridazione Esempi dell uso pratico del sondaggio mediante ibridazione Metodi di identificazione basati sulla rivelazione del prodotto della traduzione del gene clonato 167 Letture ulteriori 169 Capitolo 9 La reazione a catena della polimerasi I principi generali della reazione a catena della polimerasi La PCR in maggiori dettagli Il progetto dei primer oligonucleotidici per una PCR Scelta delle temperature corrette Dopo la PCR: studio dei prodotti della PCR I problemi dovuti alla frequenza di errore della Taq polimerasi 183 Letture ulteriori 184 Parte II Le applicazioni della clonazione dei geni e dell analisi del DNA nella ricerca Capitolo 10 Lo studio della posizione e della struttura dei geni Il modo in cui si studia la posizione di un gene Individuazione della posizione di un gene su una piccola molecola di DNA Determinazione della posizione di un gene su una grande molecola di DNA Il sequenziamento del DNA la definizione della struttura di un gene Il metodo di Sanger-Coulson nucleotidi che terminano la catena Sequenziamento automatizzato del DNA 198

5 6746 BROWN Iniziali I-XIV :57 Pagina XI Indice XI Sequenziamento dei prodotti della PCR Il metodo di Maxam-Gilbert degradazione chimica del DNA Costruzione di una lunga sequenza di DNA I risultati ottenuti con il sequenziamento del DNA 204 Letture ulteriori 205 Capitolo 11 Studio dell espressione e della funzione dei geni Studio del trascritto di un gene clonato Microscopia elettronica di molecole di acidi nucleici Analisi degli ibridi DNA-RNA mediante trattamento con nucleasi Analisi del trascritto mediante estensione del primer Altre tecniche per lo studio dei trascritti di RNA Studio della regolazione dell espressione genica Identificazione dei siti di legame di proteine su una molecola di DNA Identificazione delle sequenze di controllo mediante analisi delle delezioni Identificazione e studio del prodotto della traduzione di un gene clonato HRT e HART possono identificare il prodotto della traduzione di un gene clonato Analisi delle proteine mediante mutagenesi in vitro Studio delle interazioni proteina-proteina 232 Letture ulteriori 235 Capitolo 12 Lo studio dei genomi La genomica il modo in cui si sequenzia un genoma L approccio a shotgun al sequenziamento del genoma L approccio dei contig di cloni Uso di una mappa per assistere l assemblaggio della sequenza La postgenomica il tentativo di comprendere una sequenza genomica Identificazione dei geni in una sequenza genomica Determinazione della funzione di un gene sconosciuto Lo studio del trascrittoma e del proteoma Lo studio del trascrittoma Lo studio del proteoma 254 Letture ulteriori 257 Parte III Le applicazioni della clonazione dei geni e dell analisi del DNA in biotecnologia Capitolo 13 Produzione di proteine a partire da geni clonati Vettori speciali per l espressione di geni estranei in E. coli Il promotore è il componente cruciale di un vettore di espressione Cassette e fusioni di geni Problemi generali inerenti alla produzione di proteine ricombinanti in E. coli 272

6 6746 BROWN Iniziali I-XIV :57 Pagina XII XII Indice Problemi derivanti dalla sequenza del gene estraneo Problemi causati da E. coli Produzione di proteine ricombinanti in cellule eucariotiche Proteine ricombinanti da lievito e funghi filamentosi Uso di cellule animali per la produzione di proteine ricombinanti Pharming proteine ricombinanti da animali e vegetali vivi 279 Letture ulteriori 283 Capitolo 14 Clonazione di geni e analisi del DNA in medicina Produzione di farmaci ricombinanti Insulina ricombinante Sintesi degli ormoni umani della crescita in E. coli Fattore VIII ricombinante Sintesi di altre proteine ricombinanti umane Vaccini ricombinanti Identificazione di geni responsabili di malattie umane Identificazione di un gene di una malattia genetica Terapia genica Terapia genica di malattie ereditarie Terapia genica e cancro I problemi etici sollevati dalla terapia genica 302 Letture ulteriori 302 Capitolo 15 Clonazione dei geni e analisi del DNA in agricoltura L approccio dell aggiunta di geni all ingegneria genetica delle piante Piante che producono i propri insetticidi Piante resistenti agli erbicidi Altri progetti di aggiunta di geni Sottrazione di geni Il principio alla base della tecnologia antisenso RNA antisenso e ingegnerizzazione della maturazione dei pomodori Altri esempi dell uso di RNA antisenso nell ingegneria genetica delle piante I problemi delle piante modificate geneticamente Problemi di sicurezza con i marcatori selezionabili La tecnologia del terminatore La possibilità di effetti dannosi sull ambiente 323 Letture ulteriori 324 Capitolo 16 Clonazione dei geni e analisi del DNA in medicina legale e archeologia L analisi del DNA nell identificazione di sospetti criminali Fingerprinting genetico mediante sondaggio di ibridazione Determinazione del profilo del DNA mediante PCR di brevi ripetizioni in tandem 328

7 6746 BROWN Iniziali I-XIV :57 Pagina XIII 1. L importanza della clonazione dei geni e dell analisi del DNA XIII 16.2 Studi delle relazioni di parentela mediante determinazione del profilo del DNA Individui correlati hanno profili di DNA simili Determinazione del profilo del DNA e le spoglie dei Romanov Identificazione del sesso mediante analisi del DNA PCR dirette a sequenze specifiche del cromosoma Y PCR del gene della amelogenina Archeogenetica uso del DNA per lo studio dell evoluzione umana Le origini degli esseri umani moderni Il DNA può essere usato anche per studiare le migrazioni degli esseri umani nella preistoria 338 Letture ulteriori 340 Glossario 343 Indice analitico 357