Marcatori molecolari

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1 Marcatori molecolari Caratteristiche e applicazioni Luca Gianfranceschi e Rosanna Marino 1 I marcatori molecolari Strumento per l analisi genetica Strumento Molecolari Analisi genetica Marcatori non oggetto di studio biologia molecolare studio delle differenze genetiche approccio indiretto 2 1

2 Alcune definizioni Marcatore genetico: Mappa genetica: Distanza genetica: Locus genico che identifica univocamente una regione cromosomica Definisce le RELAZIONI LINEARI tra marcatori molecolari E IL RISULTATO DELL ANALISI GENETICA Stima della distanza esistente tra due marcatori calcolata sulla frequenza di ricombinazione - Si esprime in Centimorgan (cm) - 1cM = 1 ricombinante / 100 prodotti meiotici Polimorfismo: Presenza di varianti alleliche per un dato gene o marcatore Polimorfismo molecolare: Differenze evidenziabili a livello di DNA 3 I marcatori molecolari sono UNIVERSALI 4 2

3 I marcatori molecolari sono EREDITABILI 5 I marcatori genetici Marcatori morfologici Problemi: 1) non sono molto numerosi 2) dipendono dalla specie (ploidia ecc.) Marcatori molecolari Identificano polimorfismo a livello di DNA Offrono la possibilità di coprire tutto il genoma Sono applicabili universalmente 6 3

4 Marcatore genetico ideale Non influenzato dall ambiente Neutrale Stabile Facile da monitorare Numeroso Codominante Polimorfico Presente in qualsiasi tessuto Indipendente da sesso ed età Analisi automatizzabile N.B. Peccato che non ci sia!! 7 Tecniche per la produzione di marcatori molecolari Ibridazione molecolare Southern blot es. RFLP Amplificazione del DNA PCR (Polymerase Chain Reaction) RAPD, SSR o STR Approcci misti Digestione enzimatica e amplificazione CAPS, AFLP 8 4

5 I marcatori RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) 9 La reazione a catena della polimerasi (Polymerase Chain Reaction - PCR) Inventata da Kary Mullis nel 1985 Gli è valsa il Nobel nel 1993 Fondamenti: Conoscenze sulla replicazione del DNA - DNA polimerasi Sintesi in vitro di DNA a sequenza specifica - Oligonucleotidi Biologia dei batteri estremofili - DNA polimerasi Taq ricavata da Thermus aquaticus 10 5

6 I marcatori RAPD (Random Amplified Polymorfic DNA) Basati su PCR Non sono necessari dati di sequenza Automatizzabili Oligonucleotidi (primer) sono corti e di sequenza casuale Temperatura di annealing è bassa: 37 C Richiedono poco DNA di partenza La tecnica è facile Problemi Scarsa ripetibilità Non sono locus-specifici Non sono esportabili Difficilmente confrontabili tra mappe e tra genotipi Sono marcatori dominanti 11 Analisi RAPD di 9 varietà di ciliegio 2000 bp 1500 bp 500 bp M I campioni 1 e 3 provengono dalla stessa varietà, così come i campioni 2 e 6; nella corsia 9 è stato usato DNA di amareno 12 6

7 I microsatelliti o SSR (Simple Sequence Repeat) 13 I microsatelliti o SSR (Simple Sequence Repeat) Individuo 1 Individuo Individuo 3 Individuo 4 Individuo 5 Individuo

8 Analisi SSR di alcuni individui di una popolazione naturale Individui della popolazione Quanti alleli distinguete negli individui di questa popolazione? 15 La tecnica degli AFLP 16 8

9 Esempio di gel AFLP 17 Analisi multiplex di marcatori 18 9

10 Gli SNP (single nucleotide polymorphism)...c C A T T G A C... G G G T A A C T G......C C G T T G A C... G G G C A A C T G... Che cos è uno SNP? E una differenza, o polimorfismo, di un singolo nucleotide nella sequenza di DNA esistente in alcuni individui della stessa specie. Il loro numero varia notevolmente a seconda della specie In uomo c è in media uno SNP ogni 300 nucleotidi 19 Perché utilizzare gli SNPs Sono la base molecolare della maggior parte delle differenze tra individui Possono contribuire alla suscettibilità a malattie e all adattabilità delle specie Sono presenti in un elevato numero e sono distribuiti lungo tutto il genoma 20 10

11 Impieghi dei marcatori molecolari Analisi di paternità Diagnosi di anomalie genetiche Analisi forensi Identificazione di QTL e geni utili Miglioramento delle specie vegetali ed animali Studio della struttura, evoluzione e biodiversità delle popolazioni Studi di epidemiologia Tracciabilità dei prodotti animali e/o dei GMO Conservazione della natura Studi di filogenesi ed evoluzione

12 23 Programma di queste esercitazioni LUNEDÌ Introduzione sui marcatori molecolari e loro usi Estrazione del vostro DNA dalle cellule della mucosa boccale MARTEDÌ Spiegazione teorica sulla PCR e sull uso che ne faremo Amplificazione specifica di tre sequenze del vostro genoma 1. Marcatore altamente polimorfico D1S80 sul cromosoma 1 2. Marcatore Y-GATA-A7.2 sul cromosoma Y 3. Marcatore HUAMEL sul gene dell amelogenina sulla regione omologa dei cromosomi X e Y Preparazione dei gel di agarosio MERCOLEDÌ Elettroforesi dei prodotti di PCR sul gel di agarosio Protocollo semplificato per l estrazione di DNA da Kiwi Analisi e discussione dei risultati ottenuti 24 12