CORSO INTEGRATO DI GENETICA. a.a /11/2010. Analisi di linkage Analisi di mutazioni

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1 CORSO INTEGRATO DI GENETICA a.a /11/2010 Lezioni 27_28 Analisi di linkage Analisi di mutazioni Dott.ssa Elisabetta Trabetti

2 LINKAGE Geni in loci vicini sullo stesso cromosoma - concatenati Tendenza di loci (geni e/o marcatori) vicini su un singolo cromosoma ad essere trasmessi assieme, come una unità, attraverso la meiosi

3 [Genetica - B.A. Pierce. Zanichelli 2005]

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5 ANALISI di LINKAGE: applicazioni Mappaggio di geni malattia e di nuovi marcatori Diagnosi indiretta di malattia - Deve essere nota la localizzazione cromosomica del gene

6 LINKAGE - ricombinazione P M F1 F2 F

7 Meiosi informative e non AD Locus marcatore A Alleli 1 e 2 Meiosi informative = individuare i gameti ricombinanti e non

8 Determinazione della fase Associazione degli alleli al locus marcatore con il locus malattia 50% ricombinazione Assortimento indipendente: gene malattia NON è in linkage con il marcatore

9 Frazione di ricombinazione, θ Probabilità che avvenga un evento di ricombinazione tra due loci θ = n meiosi ricombinanti n soggetti ricombinanti n tot meiosi n tot figli θ = 0 θ = 0,5 loci molto vicini loci molto lontani o su cromosomi diversi θ = misura della distanza genetica U di misura: centimorgan cm = lunghezza genetica in cui 1% di ricombinazione (θ =0,01) NB: distanza genetica non è strettamente proporzionale alla distanza fisica (lunghezza in nucleotidi)

10 MISURA DELLA DISTANZA GENETICA θ = n. figli ricombinanti/n. tot figli = 1/8 = 0,125 = 12,5% Distanza A-B = 12,5 cm

11 COSTRUZIONE DI MAPPE GENETICHE Frazione di ricombinazione tra i loci: Ordine 3 loci sul chr A e B = 0,06 B e C = 0,07 A e C = 0,10 Frazione di ricombinazione tra i loci: A e D = 0,04 D e B = 0,08

12 MAPPA GENETICA DEL CROMOSOMA 22

13 REQUISITI Famiglie (numerose) Affetti Marcatori genetici altamente polimorfi uniformemente distribuiti facile individuazione e basso costo (A) Distinguere i due cromosomi omologhi dei genitori marcatore linked (B) Determinare la fase = cromosoma con allele patologico (C) Quale cromosoma e stato trasmesso al probando

14 ANALISI di LINKAGE: applicazioni Mappaggio di geni malattia e di nuovi marcatori Diagnosi indiretta di malattia - Deve essere nota la localizzazione cromosomica del gene

15 Informatività diagnostica di un marcatore nella analisi di linkage - AR 1/1 2/2 Famiglia non informativa 1/2 1/2 1/2 1/1 Famiglia pienamente informativa 1/2 1/2 1/2 Famiglia parzialmente informativa

16 Diagnosi prenatale CF mediante analisi di Linkage MetH: extragenico, 1Mb allele 2 p allele 1 m:?? portatore (CF carrier) o sano MWM P M CF V C

17 Diagnosi prenatale CF Xv-2c: extragenico, 200 kb allele 1 p? allele 1 m Figlio affetto: 1*p e 2*m oppure 1*m e 2*p MWM P M CF V C Feto: 1*p e 1 m oppure 1*m e 1p in entrambi i casi è PORTATORE

18 Diagnosi prenatale CF 1*-2 1-1* 1*-1* 1*-2 sano o portatore 1-2* 1*-2 1*-2* 1-1* portatore MetH: sano o carrier Xv-2c: carrier Feto: carrier m causa CF

19 Fattori che determinano l accuratezza diagnostica nella analisi di linkage Vicinanza del marcatore al gene frequenza di ricombinazione FC: KM19 <<0.01, MetH e J3.11 =0.01 DMD marcatori intragenici: 0.05 Errori da non paternità biologica Errori di laboratorio Nuove mutazioni Eterogeneità genetica

20 Analisi di linkage e studio degli aplotipi Aplotipo = serie di alleli in loci associati su un cromosoma (pat o mat)

21 LINKAGE disequilibrium Specifica combinazione di alleli in fase a due o piu loci linked che si verifica più spesso di quanto accadrebbe per puro caso Associazione a livello di popolazione tra un particolare allele marcatore e una malattia In una popolazione molte persone non imparentate hanno ereditato un cromosoma con una patologia da un antenato comune

22 LINKAGE LINKAGE DISEQUILIBRIUM M 1 M 3 M 1 M 3 Locus A alleli 1 e 2 M 1 M 1 M 3 M 3 M 2 M 3 M 2 M 2 M 2 M 3 M 3 M 3

23 Locus A Locus B 25% 25% 25% 25% 40% 10% 10% 40% 50% 0% 0% 50% Linkage equilibrium Linkage disequilibrium parziale Linkage disequilibrium completo

24 Linkage disequilibrium e FC

25 GENETICA MOLECOLARE IN MEDICINA SVILUPPI SCIENTIFICI APPLICAZIONI MEDICHE Mappatura gene Diagnosi indiretta (linkage) Identificazione gene Identificazione mutazioni Classificazione mutazioni patologiche Diagnosi diretta (mutazione)

26 Mutazione = variazione della sequenza nucleotidica rispetto ad una sequenza di riferimento -> alterazione ereditabile a carico della struttura primaria del DNA senza alcuna implicazione sul significato funzionale di tale cambiamento Effetti evolutivi = neutra, vantaggiosa, svantaggiosa Mutazione Patologica = produce una consistente alterazione della funzione svolta da un gene, determinando così l insorgenza di una malattia Polimorfismo = mutazione con frequenza >1% nella popolazione

27 Le tappe dell'analisi molecolare per le malattie genetiche Identificare e sequenziare il gene malattia Cercare le mutazioni nel gene Stabilire quali mutazioni sono patologiche Determinare se esiste una distribuzione geografica/etnica delle mutazioni Disegnare pannelli popolazione specifici Selezionare i metodi di analisi più adatti alla ricerca delle mutazioni di interesse

28 Metodi per l identificazione di mutazioni Ricerca aspecifica di mutazione, ignota o nota METODI: Sequenziamento del DNA, DGGE, DHPLC, etc.

29 Fonti DNA VILLI CORIALI SALIVA SANGUE Il DNA può essere ottenuto da qualsiasi cellula nucleata dell'organismo AMNIOCITI COLTURE CELLULARI DNA MIDOLLO OSSEO CAPELLI ALTRI TESSUTI PCR Reazione a Catena della Polimerasi DNA stampo datp, dctp, dgtp, dttp Taq polymerase, Mg++ DNA polimerasi Nuovo filamento Primer DNA stampo Primer Nuovo filamento

30 Analisi della sequenza del DNA Sequenza Normale (esone 12, gene CFTR) 1885 G>T; GAA>TAA Glu > Stop Mutazione: E585X

31 Analisi con gradiente denaturante (DGGE: Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) La Temperatura di melting (Tm) di una molecola di DNA dipendente strettamente dalla sua sequenza. Frammenti di DNA che differiscono anche per un singolo nucleotide hanno diversa Tm. Negli eterozigoti possono formarsi molecole ibride, costituite dall unione di un filamento normale e da un filamento mutato, che hanno Tm più bassa per la presenza dell appaiamento errato nel sito della mutazione. L elettroforesi in gradiente denaturante separa le molecole di DNA in funzione della diversa Tm. E così possibile identificare DNA normali e mutati perchè si arresteranno ad una diversa altezza nel gel. ALLELE NORMALE Concentrazione crescente di denaturanti G T G C G C MOLECOLE OMODUPLICI MOLECOLE ETERODUPLICI N/N N/M M/M ALLELE MUTATO A T Denaturazione, mix, rinaturazione A T A C ETERODUPLICI OMODUPLICI GEL A GRADIENTE DENATURANTE

32 Analisi DGGE dell esone 19 del gene CFTR eteroduplici - omoduplici Mutato Normale Corsie 1, 2, 4, 8, 9: DNA che non presentano mutazioni in questo esone Corsie 3, 5, 7: DNA con mutazioni in questo esone (da caratterizzare con sequenziamento) Corsia 6: controllo positivo (eterozigote I1237V)

33 Ricerca di mutazioni con DHPLC Denaturing High Performance Liquide Chromatography eteroduplici omoduplici eteroduplici omoduplici WT M

34 Le tappe dell'analisi molecolare per le malattie genetiche Identificare e sequenziare il gene malattia Cercare le mutazioni nel gene Stabilire quali mutazioni sono patologiche Determinare se esiste una distribuzione geografica/etnica delle mutazioni Disegnare pannelli popolazione specifici Selezionare i metodi di analisi più adatti alla ricerca delle mutazioni di interesse

35 Principali criteri per classificare una mutazione come causa di malattia: Correlazione con il fenotipo: la mutazione è presente negli affetti, molto rara o assente nella popolazione generale Studi funzionali, in-vitro o in-vivo, dimostrano che la mutazione causa alterazione o assenza della funzione codificata dal gene La mutazione causa una grave alterazione della struttura proteica (delezioni, inserzioni, stop, frameshift, alterazioni di splicing )

36 Le tappe dell'analisi molecolare per le malattie genetiche Identificare e sequenziare il gene malattia Cercare le mutazioni nel gene Identificare quali mutazioni sono patologiche Determinare se esiste una distribuzione geografica/etnica delle mutazioni Disegnare pannelli di mutazioni popolazione-specifici Selezionare i metodi di analisi più adatti alla ricerca delle mutazioni di interesse

37 Analisi della frequenza e della distribuzione geografica delle mutazioni Ricerca aspecifica delle mutazioni nei geni di almeno pazienti Analisi di pazienti appartenenti a popolazioni/gruppi etnici diversi Selezionare le mutazioni causa di malattia tra tutte quelle identificate Stabilire il pannello di mutazioni da analizzare in modo da coprire la maggior percentuale possibile di alleli patologici in ogni popolazione/gruppo etnico

38 Pannello Mutazioni CF per Veneto e Sardegna: Mutazione Sardegna n. % Veneto n % F508del R1162X T338I G542X AA/G N1303K G1244E G/A G/A altre TOT 146/ /225 90

39 Le tappe dell'analisi molecolare per le malattie genetiche Identificare e sequenziare il gene malattia Cercare le mutazioni nel gene Identificare quali mutazioni sono patologiche Determinare se esiste una distribuzione geografica/etnica delle mutazioni Disegnare pannelli popolazione specifici Selezionare i metodi di analisi più adatti alla ricerca delle mutazioni di interesse

40 Metodi per l identificazione di mutazioni: Analisi specifica di una mutazione nota METODI: RE; RDB/ASO; OLA.

41 REVERSE DOT BLOT: ibridazione inversa degli acidi nucleici DNA N (normale) DNA M (mutato) 1 sonda sonda N M omozigote MM 2 sonda sonda N M eterozigote NM N a C g t G c a T g t A c M 3 sonda sonda N M omozigote NN

42 RDB MULTIPLO analisi mutazioni Fibrosi Cistica (gene CFTR) STRIP A Normale F508del G542X 394delTT eteroz. R117H S1251N STRIP B sonde mutate sonde mutate sonde normali sonde normali

43 Metodi per l identificazione di mutazioni: 1) Ricerca diretta di mutazioni: Applicazioni possibili 1a) Ricerca aspecifica di mutazione, ignota o nota: significato funzionale non necessariamente noto -> identificazione nuove mutazioni, screening genetici di popolazioni numerose, (diagnosi di malattia). 1b) Analisi specifica di una mutazione nota: mutazioni patologiche -> diagnosi di malattia; polimorfismi, marcatori DNA -> identificazione individuale (medicina forense, trapianti midollo, ) 2) Analisi di Linkage: identificazione nuovi geni, diagnosi indiretta di malattia

44 Metodi per la diagnosi di malattie genetiche mediante analisi del DNA a) Analisi di mutazioni note nel soggetto (RE; RDB/ASO; OLA): Analisi diretta/specifica delle mutazioni Deve essere nota la sequenza del gene Devono essere nota l alterazione molecolare delle mutazioni da analizzare Deve essere noto quali mutazioni geniche sono causa di malattia Caratteristiche di un buon sistema di analisi: rapido, economico, multiplo b) Ricerca di mutazioni in un gene (Sequenziamento del DNA, DGGE, DHPLC): Deve essere nota la sequenza del gene Identifica sia mutazioni nuove che note; patologiche che non patologiche Solo il sequenziamento consente di caratterizzare il difetto molecolare Consentono analisi più rapida di un gene quando si hanno molti individui in esame Screening di popolazione: identifica quali e quante mutazioni sono presenti c) Analisi di Linkage Deve essere nota la localizzazione cromosomica del gene Deve essere disponibile la famiglia del probando e il DNA di almeno un familiare prossimo che sia affetto Devono essere disponibili marcatori informativi molto vicini al gene interessato

45 Perchè la diagnosi molecolare? Diagnosi di una malattia è un atto clinico Analisi mutazioni serve a: Confermare diagnosi clinica Determinare le mutazioni specifiche per successive analisi nei familiari Diagnosi Pre-Natale Identificazione dei portatori Migliorare conoscenze rapporto genotipo/fenotipo e pato-fisiologia della malattia