Strumenti della Genetica Molecolare Umana (2) Capitoli 6-7-8

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1 Strumenti della Genetica Molecolare Umana (2) Capitoli 6-7-8

2 Nota pero che Il vettore si potrebbe richiudere su se stesso per questo motivo si puo minimizzare la ricircolarizzazione: 1. trattando il vettore con fosfatasi alcalina; 2. operando una doppia digestione con due enzimi diversi che generino estremita non compatibili sia sul DNA del vettore che del DNA da clonare (la stessa digestione con gli stessi enzimi si dovrà operare sul DNA che si vuole inserire nel vettore) IN TUTTI I CASI COMUNQUE SI PUO PROCEDERE SELEZIONANDO PER IL MARCATORE DI CLONAGGIO. ES. β-galattosidasi e SISTEMA DELLE COLONIE BIANCHE/BLU I vettori di clonaggio plasmidici consentono di clonare efficacemente in E.coli frammenti di DNA fino ad alcune kilobasi, con un limite massimo di 5-10kb. Plasmidi che portano frammenti piu grandi sono spesso instabili e tendono a perdere la maggior parte del DNA inserito.

3 I batteriofagi I batteriofagi furono descritti per la prima volta intorno alla seconda decade del '900, come placche di lisi osservabili su popolazioni batteriche cresciute a confluenza su terreni solidi. Ciscuna placca rappresenta una popolazione clonale. Il fago l capace di integrarsi nel genoma batterico sfruttando delle integrasi virali, o il batteriofago µ, che si integra a caso nel cromosoma batterico sfruttando l'enzima transposasi. Il batteriofago l può utilizzare due percorsi alternativi all'interno del batterio: il ciclo litico e il ciclo lisogeno Nel primo caso il batteriofago replica il proprio corredo genetico, si assembla in virione maturo e lisa la cellula uccidendola. In altri casi invece il fago é capace di integrare il proprio DNA nel cromosoma batterico, mantenendolo in uno stato profagico inattivo e non dannoso per l'ospite batterico.

4 Il DNA del fago λ (lambda) Geni per le proteine dell involucro (8) Geni per l integrazione e ricombinazione (4) Geni per regolazione, sintesi del DNA del fago e lisi dell ospite sx Cos 45kb att ci cro Cos dx - Estremita protrundenti 5 lunghe 12 nucleotidi e complementari (coesive) cos destro e sinistro. Nella cellula in cui il fago entra le cos si appaiano e saldano mediante l azione delle ligasi cellulari e circolarizzano il DNA di λ. Puo seguire due destini: CICLO LITICO CICLO LISOGENICO (indotto dall omologia tra il gene att sul fago e batterico) - Due geni regolano il passaggio: ci domina nello stato lisogeno e cro domina nello stato litico (azione antagonista, si reprimono a vicenda) - In genere e favorito lo stato lisogeno - Per i vettori derivati dal fago λ non sono necessari i geni per la lisogenia (tratto giallo) 1. DNA del fago viene indicato come provirus 2. La cellula e lisogena

5 I vettori fagici (lambda derivati) 45kb DNA genomico Cos sinistro Cos destro Digestione con BamHI Digestione parziale con Sau3A (estremita compatibili BamHI) Isolamento braccia dx e sx Isolamento frammenti 15kb + CONCATAMERO di molti DNA fagici ricombinanti Impaccamento in vitro (taglio del concatamero in siti cos)

6 Perche due enzimi diversi pur avendo estremita compatibili? Due ordini di problemi: - Perche non usare BamHI sul DNA genomico invece di Sau3A? Ricorrenza del sito di taglio su genomico (Sau3A riconosce un sito di 4 basi e BamHI un sito di 6 basi) per cui si preferisce un taglio piu frequente per avere frammenti piu piccoli (dipendenza dalla capacita del vettore); - Perche non usare Sau3A sul vettore invece di BamHI? Nel vettore al di fuori del polylinker potrebbero esistere siti riconosciuti da Sau3A non desiderati che se riconosciuti dall enzima suddetto potrebbero generare frammenti diversi dall atteso non utilizzabili nel clonaggio!

7 Tipi diversi di vettori lambda e suoi derivati Vettori lambda di sostituzione, possono essere impaccate da 37 a 52 kb di DNA estraneo. Il frammento di DNA contenente i geni del ciclo lisogeno vengono eliminati e sostituiti dall inserto. Normalmente utilizzati per creare librerie di DNA genomico Vettori lambda di inserzione, in questo caso la grandezza degli inserti e piu piccola (fino a 10kb) dei precedenti in quanto il DNA estraneo e inserito nel gene ci responsabile del ciclo lisogeno. Normalmente utilizzati per creare librerie di cdna IN ENTRAMBI I CASI IL/I GENE/I PER LA LISOGENIA SONO ELIMINATI DAL GENOMA DEL FAGO

8 BAC, Bacterial Artificial Chromosome Caratteristiche: 1. Lungo 7-8kb 2. Resistenti al cloramfenicolo (marcatore di trasformazione) 3. puc-link rimosso durante il clonaggio e sostituito dal DNA esogeno 4. Sistema selezione SacBII (marcatore DNA ricombinante). Se si forma il gene integro nella cellula si sintetizza un composto tossico ESSENZIALI PER IL PROGETTO GENOMA UMANO Vantaggi: 1. Possibilita di clonare frammenti molto grandi (fino a 200Kb) 2. Stabilita dei cloni. Gene parb e il basso numero di copie del vettore nella cellula limitano il verificarsi di riarrangiamenti inter ed intracromosomici e la formazione di cloni chimerici (tipico degli YAC)

9 Creazione BAC libray

10 PAC, P1 Artificial Chromosome Caratteristiche: 1. Possono sopportare frammenti genomici piu piccoli (fino a Kb) 2. Resistenti alla kanamicina ESSENZIALI PER IL PROGETTO GENOMA UMANO

11 Vettori YAC, Yeast Artificial Chromosomes Il clonaggio in vettori YACs permette di clonare grossi inserti (fino a 2 Mb). Questi vettori hanno il problema di creazione di cloni chimerici (aventi più di un frammento genomico all interno derivante da regioni genomiche diverse) e della ricombinazione omologa che può portare alla formazione di ricombinanti.