Inserto bp. Vettori plasmidici pbr322 puc18

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1 Inserto bp Plasmidi 0-10 kb Fago lambda (di inserzione) 5-15 kb Fago lambda (di sostituzione) 9-23 Kb Cosmidi Kb Batteriofago P Kb PAC kb BAC kb YAC kb MAC ~ 1000 kb HAC ~ 1000 kb Vettori plasmidici pbr322 puc18 Cloning Elementi circolari di DNA a doppia elica derivati da plasmidi naturali di E.Coli, si replicano autonomamente all interno delle cellule. Un plasmide ha solitamente una distribuzione sporadica, è presente in alcune cellule e manca in altre. Caratteristiche essenziali: Ø una sequenza ori; Ø un marcatore selettivo dominante; Ø siti unici di taglio per enzimi di restrizione. 1

2 λ = DNA ds lineare Mappa del genoma di λ che mostra le posizioni dei geni (barre verticali). Proteine dell involucro Regione non essenziale Integrazione e ricombinazione Regolazione, sintesi del DNA e lisi dell ospite Cos Sinistra 12bp cl cro Cos Destra 12bp Fig Nei vettori λ di sostituzione, la regione non essenziale viene eliminata mediante digestione con enzima di restrizione, che produce un braccio sinistro e un braccio destro di λ. Un frammento di DNA estraneo può essere saldato ai due bracci al posto dell originario frammento di riempimento, garantendo la possibilità di introdurre inserti con dimensioni fino a 20-25kb. Ciclo litico cro soppressore di cl Ciclo lisogeno soppressore cl sopprime trascrizione di altri geni di λ + cro 2

3 Genoma di λ le 2 forme del suo genoma λ Genoma di λ le 4 forme del genoma di λ Il genoma del fago λ è una molecola di DNA lineare a doppio filamento lunga 48,5 kb. Al 5 di ciascuna delle estremità è presente un prolungamento a singolo filamento di 12 nt che costituisce le estremità cos. * gene attp di λ omologo a quello di E. coli 3

4 Clonaggio per sostituzione Impaccamento in vitro DNA fagico + proteine di assemblaggio Tipico vettore λ. Dopo taglio con enzima di restrizione (BamHI), la regione centrale, non essenziale, viene eliminata (dimensioni inferiori). I bracci vengono associati con un inserto che presenta estremità coesive come il vettore (BamHI). Il concatenamento che si forma è composto da ripetizioni dei bracci di λ e dell inserto, uniti dai legami che sistabiliscono fra le stremità BamHI e cos. Molecole di DNA di dimensioni inferiori a 37kb o superiori a 52-53kb non vengono impaccate. Questo determina il limite di clonaggio per inserti superiori alle 23-25kb. 4

5 Cosmide (Vettore ibrido) Si può formare una miscela di concatenameri complessa che può contenere:» vettori senza inserto,» inserti multipli consecutivi,» vettori multipli senza inserto. si possono ottenere false particelle fagiche no DNA ricombinante Per ciascuna infezione x10 5 colonie infettate/µg DNA di inserto utilizzato 5

6 Vettori Cosmidici Del plasmide possiede: funzione replicativa, polylinker, marcatori che ne permettono la selezione. Del fago λ possiede: Le estremità coesive cos, 250bp assicurano la giunzione cos (sequenze necessarie per il legame e per il taglio della terminasi Inserti fino a 45-50Kb Vettori basati sul batteriofago P1 (plasmide Ad10 con vari elementi del genoma di P1) Impacca il suo DNA in un capside che può contenere 115 Kb di DNA inserto usando sistemi di impaccamento in vitro del fago T4 inserti fino a 122 KB Dopo l infezione del batterio, il fago P1 può: attivare il ciclo litico producendo particelle fagiche e lisando il batterio reprimere il ciclo litico e mantenersi nella cellula come un grosso plasmide a basso numero di copie Il fago P1 possiede due origini di replicazione, una per controllare la replicazione litica (fagica), e l altra per mantenere il plasmide durante la crescita non litica 6

7 Replicone plasmidico di P1 Replicone litico di P1 Dimensioni del vettore: ~ 15kb sito pac siti loxp Marcatori genetici (Ap R, Tc R, Kan R, sacb) Replicone plasmidico Replicone fagico (litico) La ricombinazione sito sito-specifica La sequenza interposta tra i due siti loxp orientati come ripetizioni dirette viene deleta La sequenza interposta tra i due siti loxp orientati come ripetizioni invertite viene invertita Sito loxp riconosciuto dalla ricombinasi Cre del batteriofago P1. I siti loxp sono sequenze di 34 bp che comprendono due ripetizioni invertite di 13 bp che fiancheggiano un elemento centrale di 8 bp 7

8 Tappe del clonaggio in vettori derivati dal fago P1 Il vettore viene digerito in modo da generare due bracci che vengono defosforilati per impedirne l autosaldatura Digestione enzimatica del DNA genomico e selezione dei frammenti con dimensioni di kb Reazione di ligasi per saldare i frammenti di DNA genomico ai bracci Impaccamento in vitro del vettore ricombinante in presenza delle teste e delle code fagiche e in presenza dell enzima pacasi Infezione di un ceppo cre+ di E. coli. Nelle cellule ospiti la ricombinasi induce la circolarizzazione del vettore che inizia a replicarsi come un plasmide Si può incrementare l amplificazione del numero di copie del vettore inducendo il replicone litico del fago 8

9 Tappe del clonaggio in vettori derivati dal fago P1 Pac sito di impacchettamento di P1 2 siti loxp siti normalmente riconosciuti dalla ricombinasi del fago Proteina cre prodotta dal dal gene cre presente nel genoma di E. coli (cellula ospite) Vettore digerito con due enzimi di restrizione DNA genomico inserito nel sito della tetraciclina (BamHI) 9

10 PAC vettore plasmidico con elementi di P1 Impaccamento Estratti di impaccamento di P1: ü pacasi taglia il DNA ricombinante nel sito pac coopera con l estratto (t+c), inserendo il DNA nella testa, a partire dal sito pac (max kb) Si infetta un ceppo di E. Coli cre+: il prodotto del gene cre (ricombinasi) agisce sui siti loxp, promuovendo la circolarizzazione del plasmide. Cloni ricombinanti Kanamicina 10

11 Caratteristiche dei vettori BAC I Cromosomi Artificiali Batterici (BAC) sono vettori che derivano dal fattore sessuale F siti cos del fago λ, e lox P del fago P1: possono generare estremità (taglio specifico con terminasi di λ) utili per: mappature di restrizione dell inserto, costruire contigui di cloni. polylinker marcatori genetici selezionabili (CmR, lacz, sacb) ori S e rep E mediano la replicazione unidirezionale del fattore F i geni para e B (per la stabilità segregativa), mantengono il nr. di copie al livello di 1 o 2/genoma di E. coli, Segmento di clonaggio COS N (di λ) lox P (di P1) siti di clonaggio (H e B) siti per enzimi di restr. ricchi in GC promotori T7 e Sp6 sequenziamento inserto (giunzione) chromosome walking Fig. 1. Construction of pbac vector. The plasmid is based on a mini-f plasmid, pmbo131 11

12 Vettori YAC (Yeast Artificial Chromosome) VANTAGGI: si possono clonare sequenze eucariotiche con un organizzazione genomica di tipo ripetitivo frammenti di DNA 2 Mb SVANTAGGI: possibili chimere scarsa amplificazione. 1 YAC/cellula di lievito Componenti essenziali dei cromosomi di S. cerevisiae (si divide per gemmazione) a) centromero b) telomeri c) ARS elementi di Sequenza a Replicazione Autonoma (del DNA cromosomico) In totale poche centinaia di bp di DNA sufficienti perché il cromosoma sia funzionale in vivo nel lievito. Per costruire uno YAC combinare 4 corte sequenze 2 telomeri 1 centromero 1 sequenza ARS Queste 4 sequenze + DNA estraneo, lineare e di adeguate dimensioni cromosoma funzionale nel lievito S. cerevisiae» S. pombe, schizomicete si divide per fissione centromero molto più complesso la sua funzionalità assicurata da diverse Kb di DNA. 12

13 Costruzione di uno YAC (pyac4) Cellule di lievito ospite AB1380 AB1380 possiede una mutazione nel gene ade-2 (cellule rosse) e alleli recessivi per trp1 e ura3 (sistema di selezione) amp: gene per la resistenza all ampicillina ori: origine di replicazione per la propagazione in E. coli SUP4: gene di un trna soppressore che annulla la mutazione ade-2 (presente nel ceppo di lievito ospite) TRP1 e URA3 servono come sistema di selezione per identificare le cellule che contengono il vettore YAC 13

14 Cellula di lievito ospite AB1380 con gene mut. Ade-2 colonie rosse (fenotipo mutante) L introduzione di uno YAC con il gene SUP4 intatto (senza inserto) sopprime la mutazione ade-2 colonie incolori L introduzione di uno YAC con il gene SUP4 interrotto dal DNA clonato ripristina il fenotipo mutante colonie rosse 14

15 Cloni BAC, PAC e YAC sono stati utili per clonare grandi regioni genomiche, per generare la mappa fisica del genoma umano, identificare geni legati a malattie e per generare topi transgenici e per studi di espressione. Problemi per: espressione genica a lungo termine in cellule umane e terapia genica somatica potenziale mutazione inserzionale silenziamento del transgene in seguito ad inserimento nei cromosomi dell ospite HACs offrono un approccio alternativo Ø Replicano e segregano come cromosomi normali, usano le componenti funzionali della cellula ospite senza integrarsi, evitando così il problema di un eventuale silenziamento genico Es: gene di resistenza all igromicina in cellule ibride CHO Ø Ci si aspetta un espressione regolata e a lungo termine di piccoli e grandi loci e ridotti rischi di risposte immunitarie. TOP-DOWN approach TACF (Telomere-Associated Chromosome Fragmentation) Sviluppato per la prima volta nel Consiste nella frammentazione successiva di uno specifico cromosoma umano utilizzando un vettore che possiede: un segmento telomerico terminale, un marcatore selezionabile e una regione di omologia con il cromosoma bersaglio. Usato per cromosoma: X (0.5 Mb minicromosomi) e Y (sequenza minima α satellite 100 kb). Cellule DT 40 (linea di cellule pre-b indotte con virus leucosi) chicken B cell line DT40 allows efficient gene disruptions due to its high homologous recombination activity 15

16 Larin & Mejia, Advances in human artificial chromosome technology. TRENDS in Genetics Vol.18 No.6: June 2002 TOP-DOWN approach TACF (telomere-associated chromosome fragmentation) Sviluppato nel 1991 α DNA alfoide Y umano telomero umano neo marker (neomicina) Usati per frammentare il braccio q del cromosoma Y per ricombinazione omologa, tra centromero e il DNA alfoide in cellule ibride uomo-hamster. Selezione dei cloni + con G418 (geneticina). Secondo ciclo di frammentazione con un diverso vettore target con marker gpi guanina-fosforibosil-trasferasi Cloni + selezionati per la presenza dei marcatori in terreno HAT HAT: terreno supplementato con: Hypoxantine-Aminopterin-Thymidine HAT: terreno supplementato con Ipoxantina, Aminopterina e Timidina 16

17 Larin & Mejia, Advances in human artificial chromosome technology. TRENDS in Genetics Vol.18 No.6: June 2002 BOTTOM-UP approach Si ottengono cromosomi artificiali introducendo frammenti centromerici e telomerici clonati in cellule umane in coltura per formare HAC che vanno da 1 a 10 Mb. Co-transfezione con mix di sequenze alfoidi umane sintetiche, telomeri, DNA genomico e un marcatore in HT1080 (linea cellulare di fibrosarcoma). - DNA alfoide umano è clonato in un grande costrutto con marker (neo) e usato per trasfettare cellule umane. - Cloni stabili che sono neomicina resistenti in seguito a selezionei con G418 (antib.) sono quindi analizzati per la formazione di HAC. La struttura del DNA dell HAC consiste di multimeri del DNA input. HT1080 (linea cellulare di fibrosarcoma) G418: geneticina 17

18 Grimes & Monaco, Artificial and engineered chromosomes: developments and prospects for gene therapy. Chromosoma (2005) 114: DOI /s TACF (telomere-associated chromosome fragmentation) Fig. 3 Chromosome transfer. a, b Human minichromosomes (arrows) were generated by TACF. a Human 21-based minichromosome (21ΔpqHAC) in CHO cells. 21ΔpqHAC was detected using human Cot1 (red) and EGFP transgene (green) probes. b A human X minichromosome ( 500 kb in size) in chicken DT40 cells was detected with a DXZ1 alpha satellite probe (red). CENP-C (green) assembles on chicken micro- and macrochromosomes and also on the minichromosome. c, d Characterization of a human de novo HAC in mouse LA-9 cells. c The D17Z1 probe (green) hybridizes with the HAC (arrow). The mouse minor satellite probe (in red) hybridizes exclusively with mouse centromere regions. d CENP-C (green) is detected on the HAC (red, arrow) in LA-9 cells as well as at mouse centromeres. Insets in a d show larger version of the minichromosomes (a, b) or de novo HACs (c, d) chicken B cell line DT40 allows efficient gene disruptions due to its high homologous recombination activity a. Sonda human Cot1 Sonda EGFP transgene b. Minicromosoma X umano (~ 500Kb) in cellule di pollo DT40: - α-satellite DXZ1 - CENP-C c-d. HAC in cellule di topo LA-9 c. D17Z1 ibroda con HAC satellite minor di topo ibrida solo con centromero di topo. d. CENP-C ibrida su HAC CHO: Chinese hamster ovary. 18

19 Larin & Mejia, Advances in human artificial chromosome technology. TRENDS in Genetics Vol.18 No.6: June 2002 Due tra i metodi usati per esprimere il gene HPRT portato da un HAC per complementare cellule mutate per il gene HPRT. a. costrutto di 440kb con αdna del cr 17 locus genomico HPRT1 da Xq26.2 due marcatori neomicina e puromicina. Costrutto usato per trasfettare locus genomico HPRT1 da Xq26.2. b. due diversi costrutti 21 αdna (90 kb) e locus HPRT1 da Xq26.2 (160kb) sono stati co-trasfettati in cellule HT1080. HPRT: (hypoxhanthine guanine phosporibosyltransferase) I due costrutti ricombinano insieme nel nucleo e formano un HAC funzionale che complementa la deficienza in HPRT1. - Entrambi gli approcci producono copie multiple del DNA input. Efficienza 20-80% HAC stabili per diversi mesi in assenza di selezione Segregazione accurata nel 98% delle mitosi Selezione dei cloni+ con G418 (geneticina). (analogo della neomicina solfato) 19

20 Macnab and Whitehouse, Gene Therapy, 16: , 2009 AC Artificial Chromosome BAC Bacterial Artificial Chromosome HAC Human Artificial Chromosome PAC P1-derived Artificial Chromosome YAC Yeast Artificial Chromosome 20

21 Potential characteristics of human artificial chromosomes (HACs) Kazuki and Oshimura, Molecular Therapy, 19 9, , b The size limits depend on each vector. (c,d) Limitations and consequences of gene delivery with conventional vectors such as a virus or plasmid, and with HACs, respectively. 21

22 Kazuki and Oshimura, Molecular Therapy, 19 9, , An example for the construction of engineered human artificial chromosomes (HACs) via top-down approach and subsequent gene delivery. HAC ideale: NON deve contenere geni endogeni del cromosoma di partenza EGFP: Enhanced Green Fluorescent Proteine transgene The Cre-lox system is used as a genetic tool to control site specific recombination events in genomic DNA. Microcell-Mediated Chromosome Transfer The ds DNA is cut at both loxp sites by the Cre protein The strands are then rejoined with DNA ligase. MMCT: Microcell- Mediated Chromosome Transfer chicken B cell line DT40 allows efficient gene disruptions due to its high homologous recombination activity 22

23 Thus, the resulting 21HAC vector contains four useful features: (i) it has a well-defined genetic architecture; (ii) it is episomally present, independent of the host chromosomes; (iii) it is mitotically stable in human somatic cells in vitro and mouse cells both in vitro and in vivo; and (iv) it has a system for safeguarding against tumor formation. Furthermore, any desired gene could be cloned into the 21HAC using the Cre-loxP system in Chinese hamster ovary cells, or by a homologous recombination system in DT40 cells. 23

24 Kazuki and Oshimura, Molecular Therapy, 19 9, , Schematic diagram of the human artificial chromosome (HAC) vector system for functional analyses and for the treatment of genetic disorders. (a) HAC construction with gene(s) of interest. ips: induced pluripotent stem HSC: hematopoietic stem cell MAB: mesoangioblast mgs: multipotent germline stem MSC: mesenchymal stem cell 24

25 Oshimura et al., A pathway from chromosome transfer to engineering resulting in human and mouse artificial chromosomes for a variety of applications to bio-medical challenges. Chromosome Res (2015) 23: DOI /s z Microcell-mediated chromosome transfer (MMCT) is a technique to transfer a chromosome from defined donor cells into recipient cells and to manipulate chromosomes as gene delivery vectors and open a new avenue in somatic cell genetics. However, it is difficult to uncover the function of a single specific gene via the transfer of an entire chromosome or fragment, because each chromosome or fragment contains a set of numerous genes. Thus, alternative tools are human artificial chromosome (HAC) and mouse artificial chromosome (MAC) vectors, which can carry a gene or genes of interest. HACs/MACs have been generated mainly by either a top-down approach (engineered creation) or a bottom-up approach (de novo creation). HACs/MACs with one or more acceptor sites exhibit several characteristics required by an ideal gene delivery vector, including stable episomal maintenance and the capacity to carry large genomic loci plus their regulatory elements, thus allowing the physiological regulation of the introduced gene in a manner similar to that of native chromosomes. The MMCT technique is also applied for manipulating HACs and MACs in donor cells and delivering them to recipient cells. This review describes the lessons learned and prospects identified from studies on the construction of HACs and MACs, and their ability to drive exogenous gene expression in cultured cells and transgenic animals via MMCT. New avenues for a variety of applications to bio-medical challenges are also proposed. 25

26 Oshimura et al., A pathway from chromosome transfer to engineering resulting in human and mouse artificial chromosomes for a variety of applications to bio-medical challenges. Chromosome Res (2015) 23: DOI /s z Fig.1 Microcell mediated chromosome transfer (MMCT) for generation of monochromosomal hybrid cells and trans-chromosomic mice. First Step G418: geneticina Obain r : selective agent in the isolation of somatic cell hybrids First step: marking human chromosome in the fibroblasts with a selection marker and fusing the fibroblasts with mouse A9 cells. Second Step: marked human chromosome from the donor hybrid to the recipient A9 cells. - micronucleation of the donor hybrids by colcemid treatment, - enucleation (cytochalasin B) - purification of the microcells - fusion with the recipient A9 cells - drug selection of the microcell hybrids - identification of the transferred human chromosome by FISH, and DNA analyses 26

27 Oshimura et al., A pathway from chromosome transfer to engineering resulting in human and mouse artificial chromosomes for a variety of applications to bio-medical challenges. Chromosome Res (2015) 23: DOI /s z Fig. 2 Two types of gene loading to HAC. (a) Construction of a human artificial chromosome (HAC) vector from human chromosome 21 using the top- down approach. The 21 HAC is equipped with a loxp site for loading the gene of interest. A site specific recombination event mediated by Cre recombinase is selected by reconstruction of the functional HPRT gene, which confers hypoxanthine-aminopterin-thymidine (HAT) resistance. (b) The gene of interest, isolated in a circular vector, is introduced into the HAC by sitespecific insertion. (c) A megabase- size gene locus, which is above the capacity of circular cloning vectors, is introduced into the HAC by site-specific reciprocal chromosome translocation. 27

28 Kazuki Y. and Oshimura M. Human Artificial Chromosomes for Gene Delivery and the Development of Animal Models Molecular Therapy, vol. 19 no. 9, sep Macnab S. and Whitehouse A. Progress and prospects: human artificial chromosomes. Gene Therapy, 16, , 2009 Oshimura et al., A pathway from chromosome transfer to engineering resulting in human and mouse artificial chromosomes for a variety of applications to bio-medical challenges. Chromosome Res (2015) 23: DOI /s z 28