Strumenti della Genetica Molecolare Umana (1) Capitoli 6-7-8

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1 Strumenti della Genetica Molecolare Umana (1) Capitoli Paper to read and thesis

2 Metodi generali per lo studio di sequenze che facciano parte di una popolazione composita di DNA

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5 Clonaggio del DNA Tappe: 1. Isolamento del DNA 2. Taglio del DNA con enzimi di restrizione 3. Clonaggio in vettori 4. Introduzione dellla molecola ricombinante in una cellula ospite (trasformazione) CLONAGGIO MOLECOLARE

6 Clonaggio del DNA Tappe: 1. Isolamento del DNA 2. taglio del DNA con enzimi di restrizione 3. Clonaggio in vettori 4. Introduzione della molecola ricombinante in una cellula ospite (trasformazione) CLONAGGIO MOLECOLARE

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9 Enzimi di restrizione 1. Enzima che riconosce una specifica sequenza (sito di restrizione) che puo essere di 4bp, 6bp o 8bp che possiede un asse di simmetria e per questo e definita palindrome 2. Puo tagliare il DNA in corrispondenza del sito riconosciuto o produrre tagli lontano dal sito riconosciuto (piu raramente) 3. I frammenti prodotti possiedono un estremita 5 -P ed un 3 -OH 4. Vengono utilizzati per produrre un pool di frammenti di DNA che possono essere clonati Principalmente trovati in alcuni batteri per cui rappresentano un sistema di difesa da DNA estraneo. Il batterio protegge il proprio DNA metilando i siti di restrizione che cosi non sono piu riconosciuti dall enzima di restrizione.

10 Quanti siti di riconoscimento ci sono nel genoma? Supponendo che il DNA abbia una composizione in basi uguale (50% GC) ed una distribuzione delle basi e del tutto casuale... la probabilita di trovare una qualsiasi sequenza e data dal prodotto delle probabilita delle singole basi costituenti. 5 -ACGG-3 P( 3 -TGCC-5 ) = 1/4 x 1/4 x 1/4 x 1/4 =1/256 In generale si puo ricavare la probabilita di un sito di restrizione considerando in numero delle basi che lo compongono: Basi nel sito di restrizione n Probabilita di trovare il sito di restrizione (1/4) 4 = 1 ogni 256 basi (1/4) 5 = 1 ogni 1024 basi (1/4) 6 = 1 ogni 4096 basi (1/4) 8 = 1 ogni basi (1/4) n Piu e piccolo e il sito di restrizione riconosciuto piu e probabile trovarlo nel genoma!!! ma il DNA di ogni organismo ha una propria composizione in basi e la distribuzione delle basi non e del tutto casuale

11 Enzimi di restrizione II...quando il DNA viene tagliato con un dato enzima il risultato e un ampia gamma di dimensioni dei frammenti. Gli enzimi posso tagliare il DNA in modo differente: 1. alcuni enzimi come HaeIII tagliano la molecola di DNA dando origine ad estremita piatte; 2. altri come EcoRI producono tagli sfalsati producendo estremita coesive a. l estremita sporgente puo essere 5 (EcoRI) b. l estremita sporgente puo essere 3 (PstI) 5 3 CCCGGG GGGCCC GGATCC CCTAGG CTGCAG GACGTC 3 5 Taglio con SmaI Taglio con BamHI Taglio con PstI CCC GGG GGG 3 CCC Prof. Estremita Mario Ventura piatte (blunt) G 5 G CCTAG Estremita 5 sporgenti GATCC G CTGCA G ACGTC Estremita 3 sporgenti

12 Enzimi di restrizione III Gli enzimi che producono estremita sfalsate (sticky ends) sono estrememente utili nel clonaggio. Tagliando il DNA del vettore e quello che si desidera clonare, con lo stesso enzima di restrizione, si generano estremita appiccicose che si riconoscono tra loro!!! Gli enzimi che producono estremita piatte (blunt ends) sono utilizzati anche loro in strategie di clonaggio molecolare, ma in questo caso devono essere utilizzati accorgimenti tecnici particolari prima di mettere a contatto i DNA vettore e da clonare (come nel clonaggio cdna) Se le estremita di due pezzi di DNA - il DNA di un vettore di clonaggio e il DNA che si vuole clonare - prodotti dall azione dello stesso enzima si incontrano in soluzione si ha un appaiamento di basi (le due estremita a singola elica si riassociano)

13 TAGLIO E LIGASI TRA DUE DNA DIFFERENTI 3 GAATTC 5 5 CTTAAG 3 3 GAATTC5 5 CTTAAG3 Taglio con EcoRI (estremita coesive) 5 G 3 CTTAA AATTC 3 G 5 Miscela dei digeriti 5 G 3 CTTAA AATTC 3 G 5 LIGASI 5 G AATTC 3 3 CTTAA G 5 5 G AATTC 3 3 CTTAA G 5 5 G AATTC 3 3 CTTAA G 5 DNA RICOMBINANTE 5 G AATTC 3 3 CTTAA G 5

14 Clonaggio (e non clonazione) del DNA Tappe: 1. Isolamento del DNA 2. Taglio del DNA con enzimi di restrizione 3. Clonaggio in vettori, si tagliano e mescolano i due differenti tipi di DNA (vettore e DNA da clonare) con lo stesso enzima o con enzimi compatibili e si lascia agire la ligasi! 4. Introduzione dellla molecola ricombinante in una cellula ospite (trasformazione) CLONAGGIO MOLECOLARE

15 I vettori di clonaggio I vettori sono molecole di DNA capaci di trasportare e replicare frammenti di DNA estraneo e diversi da se stesso Si distinguono per le proprieta molecolari e per la dimensione massima del DNA che puo essere portata all interno dal vettore (capacita del vettore): vettori plasmidici (a bassa capacita ) vettori basati sul fago lambda (a bassa capacita ) vettori fosmidici (a bassa capacita ) YAC, PAC e BAC (vettori ad alta capacita ) Vettori di clonaggio vettori plasmidici standard vettori lambda di inserzione vettori lambda di sostituzione vettori fosmidici vettori PAC vettori BAC vettori YAC Dimensioni dell inserto fino a 10kb fino a 10kb 9-23kb 35-42kb kb fino a 300kb 02-2Mb

16 I vettori di clonaggio II

17 CARATTERISTICHE GENERALI: I vettori di clonaggio III 1. Devono possedere la capacita di replicarsi (ori di replicazione) nel genoma della cellula ospite 2. Siti unici di restrizione, il vettore deve essere tagliato solo in un sito del suo genoma la cui localizzazione deve essere nota. Per questo motivo la maggiore parte dei vettori e ingegnerizzata e munita di un polylinker 3. Marcatore selettivo di trasformazione. Devono presentare dei marcatori genici che permettano di distinguere una cellula che porta il vettore da una cellula che non lo porta 4. Marcatore della ricombinazione. Devono presentare dei marcatori genici che permettano di distinguere se il vettore porta il frammento che si vuole clonare o se e tal quale (privo di inserto)

18 I vettori plasmidici Il vettore plasmidico e costituito da: a. Origine di replicazione (ori) b. Polylinker c. Marcatore di trasformazione (la resistenza d un antibiotico, amp r ) d. Marcatore della ricombinazione (gene per la β-galattosidasi) Es. puc19

19 Uno sguardo rapido sull operone del lattosio (in assenza di lac)

20 Uno sguardo rapido sull operone del lattosio (in presenza di lac)

21 Marcatore per il DNA ricombinante LacZ e un gene che codifica per la β- galattosidasi un enzima che viene prodotto dalle cellule batteriche se in presenza di lattosio (induttore). Questo gene puo essere utilizzato come marcatore della ricombinazione! Il gene lacz ha il polylinker localizzato all interno in frame ed e in grado di codificare per l enzima funzionante Se nel polylinker e inserito un frammento di DNA estraneo il gene lacz non codifica per l enzima β-galattosidasi e perde la capacita di metabolizzare il lattosio e substrati cromogeni come l X-gal. Se si induce nelle cellule batteriche trasformate l operone Lac (utilizzando l IPTG, isopropiltiogalattoside) le cellule capaci di colorarsi (blu) avranno il gene β-galattosidasi integro e non saranno ricombinanti viceversa le colonie bianche saranno le ricombinanti (quelle che stiamo cercando!!!!)

22 Marcatore per il DNA ricombinante II Metodo della doppia resistenza ad antibiotici In grassetto i siti di restrizione presenti in doppio In relazione a quale enzima di restrizione viene utilizzato si presuppone che il batterio ricevente il plasmide con l inserto perda una delle due resistenze (ampicillina o tetraciclina) pbr322 Come si seleziona un carattere batterico?

23 1. Come si identificano e contano i mutanti batterici? Sistemi di selezione 2. Quali sono i caratteri che si seguono? - biosintesi di aminoacidi - utilizzo di zuccheri - resistenza ad antibiotici I batteri si definiscono auxotrofi se sono incapaci di sintetizzare molecole essenziali, ceppi che viceversa sono capaci di sintetizzare tutte le molecole essenziali sono definiti prototrofi

24 Replica plating

25 Selezione per mutanti della biosintesi di aa si cercano i mutanti aa - (esempio trp - ) Partiamo da wild-type (trp + ) batteri trp - replica plating coltura (10 9 batteri) terreno con trp crescono trp +/- terreno minimo crescono trp + In questo modo dalla coltura di partenza e possibile isolare cloni mutanti per il trp

26 Selezione per mutanti dell utilizzo di zuccheri si cercano i mutanti zucchero - (esempio lac -, lattosio - ) Partiamo da wild-type batteri lac + replica plating coltura (10 9 batteri) terreno minimo crescono lac +/- terreno con lattosio crescono lac + In questo modo dalla coltura di partenza e possibile isolare cloni mutanti per il lattosio

27 Selezione per mutanti della resistenza ad antibiotici si cercano i mutanti antibiotico r (esempio strp r, streptomicina resistente) Partiamo da wild-type batteri strp r replica plating coltura (10 9 batteri) terreno minimo crescono strp r/s terreno con strept. crescono strp r In questo modo dalla coltura di partenza e possibile isolare cloni resistenti alla streptomicina

28 Clonaggio con puc19 amp r EcoRI Digestione con EcoRI EcoRI EcoRI Solo le colonie bianche hanno il DNA RICOMBINANTE Estrazione DNA Isolamento Estremita appicicose APPAIAMENTO E LIGASI Estremita appicicose Crescono solo i batteri con il DNA del vettore ricombinante e non DNA RICOMBINANTE VETTORE Piastra su terreno selettivo con antibiotico e X-Gal TRASFORMAZIONE DIVISIONI CELLULARI Crescita in terreno con sistema selezione amp

29 Nota pero che Il vettore si potrebbe richiudere su se stesso per questo motivo si puo minimizzare la ricircolarizzazione: 1. trattando il vettore con fosfatasi alcalina; 2. operando una doppia digestione con due enzimi diversi che generino estremita non compatibili sia sul DNA del vettore che del DNA da clonare (la stessa digestione con gli stessi enzimi si dovra operare sul DNA che si vuole inserire nel vettore) IN TUTTI I CASI COMUNQUE SI PUO PROCEDERE SELEZIONANDO PER IL MARCATORE DI CLONAGGIO. ES. β-galattosidasi e SISTEMA DELLE COLONIE BIANCHE/BLU I vettori di clonaggio plasmidici consentono di clonare efficacemente in E.coli frammenti di DNA fino ad alcune kilobasi, con un limite massimo di 5-10kb. Plasmidi che portano frammenti piu grandi sono spesso instabili e tendono a perdere la maggior parte del DNA inserito.

30 Piccolo test: trova al differenza Gel 2 Gel 1 Gel 1. digestione DNA genomico Gel 2. Digestione inserto cloni genomici

31 I batteriofagi I batteriofagi furono descritti per la prima volta intorno alla seconda decade del '900, come placche di lisi osservabili su popolazioni batteriche cresciute a confluenza su terreni solidi. Ciscuna placca rappresenta una popolazione clonale. Il fago l capace di integrarsi nel genoma batterico sfruttando delle integrasi virali, o il batteriofago µ, che si integra a caso nel cromosoma batterico sfruttando l'enzima transposasi. Il batteriofago l può utilizzare due percorsi alternativi all'interno del batterio: il ciclo litico e il ciclo lisogeno Nel primo caso il batteriofago replica il proprio corredo genetico, si assembla in virione maturo e lisa la cellula uccidendola. In altri casi invece il fago é capace di integrare il proprio DNA nel cromosoma batterico, mantenendolo in uno stato profagico inattivo e non dannoso per l'ospite batterico.

32 Il DNA del fago l (lambda) Geni per le proteine dell involucro (8) Geni per l integrazione e ricombinazione (4) Geni per regolazione, sintesi del DNA del fago e lisi dell ospite sx Cos 45kb att ci cro Cos dx - Estremita protrundenti 5 lunghe 12 nucleotidi e complementari (coesive) cos destro e sinistro. Nella cellula in cui il fago entra le cos si appaiano e saldano mediante l azione delle ligasi cellulari e circolarizzano il DNA di λ. Puo seguire due destini: CICLO LITICO CICLO LISOGENICO (indotto dall omologia tra il gene att sul fago e batterico) - Due geni regolano il passaggio: ci domina nello stato lisogeno e cro domina nello stato litico (azione antagonista, si reprimono a vicenda) - In genere e favorito lo stato lisogeno - Per i vettori derivati dal fago l non sono necessari i geni per la lisogenia (tratto giallo) 1. DNA del fago viene indicato come provirus 2. La cellula e lisogena

33 I vettori fagici (lambda derivati) 45kb DNA genomico Cos sinistro Cos destro Digestione con BamHI Digestione parziale con Sau3A (estremita compatibili BamHI) Isolamento braccia dx e sx Isolamento frammenti 15kb + CONCATAMERO di molti DNA fagici ricombinanti Impaccamento in vitro (taglio del concatamero in siti cos)

34 Perche due enzimi diversi pur avendo estremita compatibili? Due ordini di problemi: - Perche non usare BamHI sul DNA genomico invece di Sau3A? Ricorrenza del sito di taglio su genomico (Sau3A riconosce un sito di 4 basi e BamHI un sito di 6 basi) per cui si preferisce un taglio piu frequente per avere frammenti piu piccoli (dipendenza dalla capacita del vettore); - Perche non usare Sau3A sul vettore invece di BamHI? Nel vettore al di fuori del polylinker potrebbero esistere siti riconosciuti da Sau3A non desiderati che se riconosciuti dall enzima suddetto potrebbero generare frammenti diversi dall atteso non utilizzabili nel clonaggio!

35 Tipi diversi di vettori lambda e suoi derivati Vettori lambda di sostituzione, possono essere impaccate da 37 a 52 kb di DNA estraneo. Il frammento di DNA contenente i geni del ciclo lisogeno vengono eliminati e sostituiti dall inserto. Normalmente utilizzati per creare librerie di DNA genomico Vettori lambda di inserzione, in questo caso la grandezza degli inserti e piu piccola (fino a 10kb) dei precedenti in quanto il DNA estraneo e inserito nel gene ci responsabile del ciclo lisogeno. Normalmente utilizzati per creare librerie di cdna IN ENTRAMBI I CASI IL/I GENE/I PER LA LISOGENIA SONO ELIMINATI DAL GENOMA DEL FAGO