Il CLONAGGIO E LA CLONAZIONE

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1 Il CLONAGGIO E LA CLONAZIONE

2 CLONAZIONE Dal greco Klon ( germoglio ) Clonare creare organismi con identico DNA di uno stesso progenitore La questione della clonazione è strettamente collegata alla ricerca sulle cellule staminali perché l embrione clonato rappresenta una fonte di cellule staminali Nel mondo animale si distingue: CLONAZIONE TERAPEUTICA CLONAZIONE RIPRODUTTIVA

3 LEGISLAZIONE Convenzione sulla Bioetica del Consiglio d Europa (Oviedo, 1997) Vieta: clonazione ai fini riproduttivi clonazione di embrioni umani ai fini di ricerca Non vieta: utilizzo degli embrioni sovrannumerari (ogni Stato membro decide autonomamente).

4 LA CLONAZIONE Il metodo principale è quello del trasferimento nucleare: si utilizza una cellula uovo che viene privata del nucleo. Il nucleo viene sostituito iniettando nella cellula il nucleo di una cellula dell organismo di interesse. In particolari condizioni, si spera che il nucleo (che contiene, in potenza, tutta l informazione necessaria) venga riprogrammato dal citoplasma embrionale dell oocita, a ripercorrere dall inizio il processo di sviluppo.

5 CLONAZIONE DELLA PECORA DOLLY

6 INSUCCESSI DELLA CLONAZIONE 1) Attenzione al DNA citoplasmatico: la cellula contiene anche i mitocondri, che sono dotati di DNA proprio. Il macchinario della respirazione cellulare è però un mosaico di proteine codificate dal nucleo e proteine codificate dal mitocondrio Quindi c è un elevato e ancora poco noto cross-talk tra nucleo e mitocondri per coordinare l espressione genica e la sintesi delle proteine coinvolte nel trasporto elettronico mitocondriale. Codificate dal nucleo: in azzurro

7 INSUCCESSI DELLA CLONAZIONE 2) Epigenetica: il DNA genomico è fortemente modificato durante la vita di una cellula (metilazione del DNA, metilazioni/acetilazioni etc degli istoni..). Alcune modificazioni disattivano o attivano determinati pacchetti genici e vengono ereditate durante la replicazione cellulare. Lo «stato» epigenetico del DNA nucleare identifica l identità cellulare.

8 IL CLONAGGIO Clonaggio: procedura che permette di ottenere tante copie dello stesso gene, in forma purificata, utilizzando cellule vive. Si inserisce un singolo frammento di DNA in una singola cellula batterica attraverso una piccola molecola di DNA che serve da trasportatore (VETTORE DI CLONAGGIO). La cellula replicandosi replica il DNA inserito migliaia o milioni di volte. Perché clonare? Per studiare geni noti e non noti (sequenziamento) Per utilizzarli come sonde per studiarne l espressione in tessuti o interi organismi. Per costruire librerie (library)

9 Il clonaggio in sintesi: attività degli enzimi di restrizione e della DNA ligasi

10 Il clonaggio utilizza diverse metodologie: 1- Un metodo per tagliare il DNA in punti precisi: le ENDONUCLEASI DI RESTRIZIONE 2- Un metodo per unire covalentemente due frammenti di DNA: DNA LIGASI 3- Una piccola molecola di DNA capace di autoreplicarsi: VETTORE DI CLONAGGIO (plasmidi, cosmidi, fagi, BAC,YAC ecc). Quando queste molecole contengono DNA di differente origine vengono dette ricombinanti. 4- UNA CELLULA OSPITE che fornisce l apparato enzimatico necessario per la replicazione del DNA ricombinante (batteri o lieviti). 5- Un metodo per la SELEZIONE delle cellule ospiti che contengano il DNA ricombinante.

11 TAPPE CARATTERISTICHE DI UN CLONAGGIO 1- DIGESTIONE (Taglio del DNA da clonare e del vettore di clonaggio) 2- LIGAZIONE (Unione del DNA-inserto- da clonare e del vettore di clonaggio) 3- TRASFORMAZIONE (inserimento del vettore ricombinante in cellula ospite) 4- PIASTRAMENTO (replicazione dei cloni in terreno nutritivo) 5- SELEZIONE (riconoscimento delle cellule con vettore ricombinante).

12 CLONAGGIO -PREPARAZIONE DI VETTORE E INSERTO - LIGASI - TRASFORMAZIONE - SELEZIONE - CRESCITA COLONIE

13 LIGAZIONE I prodotti della reazione di ligazione possono essere molecole di diverso tipo: Molecole ricombinanti (vettore +inserto) Molecole con solo vettore (si è richiuso su se stesso, non ha l inserto) Molecole di solo inserto richiuse su se stesse Molecole di vettore rimaste lineari N.B. Solamente le prime due possono formare ceppi trasformati, capaci di crescere in un terreno selettivo con antibiotico

14 Resistenza agli antibiotici: (Selezione dei plasmidi) Solo i batteri che hanno integrato un plasmide codificante il gene per la resistenza possono crescere su agar nutritivo in presenza di antibiotico

15 Sistema di Trasferimento del DNA in cellula bersaglio Inserire la sequenza d interesse: Promotore Gene/i o sequenza target può essere una sequenza codificante (proteina strutturale, enzima ) oppure una sequenza regolatrice (codificante per un RNA con attività di regolazione dell espressione genica di altri geni) Terminatore. Inserire, se serve, un marcatore di selezione: Promotore; Un gene per la degradazione di un antibiotico o un erbicida (se si utilizza l antibiotico, solamente le cellule trasformate potranno sopravvivere) oppure un gene per una proteina fluorescente (eccitate ad opportuna lunghezza d onda, le cellule trasformate saranno fluorescenti!) Terminatore.

16 Inserimento del vettore ricombinante in cellula ricevente 1) TRASFORMAZIONE (se la cellula è batterica) 2) TRASFEZIONE (se la cellula è eucariotica) Esistono varie tecniche: Shock termico in CaCl 2 (per cellulule batteriche) Elettroporazione (cellule batteriche ed eucariotiche vegetali prive di parete-) Utilizzo di liposomi (lipidi cationici) Bombardamento biolistico (cellule vegetali) Utilizzo di Agrobacterium Tumefaciens (cellule vegetali) Microiniezione (in cellule embrionali) Utilizzo di Virus

17 Il complesso Ca 2+- DNA viene assorbito dalla cellula. Per trasformare i batteri questo metodo si accoppia ad uno shock termico a 42 C e poi in ghiaccio. Shock in cloruro di calcio

18 Elettroporazione Le cellule batteriche vengono esposte ad un campo elettrico ad alta intensità che destabilizza momentaneamente le membrane; Durante questa destabilizzazione, la membrana risulta permeabile alle molecole che circondando la cellula, e quindi il DNA esterno penetra all interno delle cellule. - Una volta che il campo elettrico termina, i pori formati sulla membrana si chiudono e il DNA rimane intrappolato dentro alla cellula.

19 Elettroporazione Si può applicare a batteri e lieviti, cellule animali (es cellule staminali o cellule primarie) e cellule vegetali private della parete cellulare (protoplasti) Incubando pezzetti di foglia in una soluzione contenente un osmoregolatore ed enzimi che digeriscono la parete cellulare (cellulasi, pectinasi, emicellulasi), si possono isolare i protoplasti Si utilizza uno strumento definito «elettroporatore»

20 Lipidi cationici i lipidi cationici sono molecole anfifiliche formate da una testa polare ed una coda idrofobica apolare. Le interazioni elettrostatiche tra le teste cationiche e il fosfato (carico negativamente) del DNA permette l associazione spontanea tra DNA e lipide cationico. Il complesso DNA-liposomi si fonde con la membrana plasmatica ed entra nella cellula bersaglio.

21 Metodo biolistico Metodo valido sia per le cellule animali che per le cellule vegetali: il vettore in cui è clonato il gene d interesse viene fatto precipitare su particelle (proiettili) di tungsteno o oro che vengono sparate ad alta velocità (400 m/s) all interno del tessuto da un apparato detto particle gun.

22 Agrobacterium Il batterio Gram negativo del suolo (Agrobacterium) può infettare le piante trasferendo alla cellula vegetale parte del DNA che alloggia su un plasmide batterico. I ceppi di Agrobatterio virulenti ospitano (oltre al proprio genoma!) un PLASMIDE di virulenza, che a seconda della patogenesi indotta si classifica come: -Ti (Tumor inducing) - Ri (root hairy inducing)

23 Agrobacterium Un ferita della zona radicale o del colletto della pianta, determina la secrezione nel terreno di composti fenolici (come acetosiringone e simili). Tali composti vengono «sentiti» dall Agrobatterio, che attiva il processo di trasformazione genetica

24 PROBLEMI RELATIVI ALLA TRASFORMAZIONE GENETICA: 1. Distinzione tra trasformazione transiente (senza integrazione nel genoma) o stabile (il transgene si integra nel genoma) 2. Insorgenza di mutazione nel sito di inserzione 3. l integrazione del transgene nel genoma della cellula bersaglio avviene in una POSIZIONE RANDOM, quindi possono insorgere «effetti di posizione» svantaggiosi o non desiderati (ad es, il transgene non si esprime) oppure si possono interrompere geni essenziali (ad es, la cellula che ha integrato il transgene muore) 4. Il transgene viene riconosciuto come non-self e man mano che le generazioni proseguono, subisce un processo di silenziamento (intervento epigenetico?) 5. (trasduzione) Creazione di nuovi ceppi virali, ottenuti per ricombinazione di sequenze virali già presenti nel genoma ospite, che ricombinano con la sequenza del virus ingegnerizzato; 6. Insorgenza di reazioni immunitarie dovute all attacco virale;

25 Come selezionare le cellule che contengono il plasmide ricombinante da quelle che lo hanno vuoto? Una possibilità è l utilizzo di un test colorimetrico (bianco o blu) che sfrutta il funzionamento dell operone lac. Selezione Bianco-Blu I vettori della serie puc possono esprimere, sotto il controllo del promotore del lattosio, un piccolo peptide, corrispondente alla parte N-terminale della Betagalattosidasi (il prodotto genico di lacz). Utilizzando, in terreno solido, un substrato cromogenico come l' X-Gal (5-bromo- 4-cloro-3-indolil-Betagalattoside) l'attività enzimatica viene espressa con una conseguente colorazione delle colonie in BLU. Poiché il polilinker di puc é situato nel gene che codifica il peptide, l'inserzione di un frammento di DNA estraneo, ne interrompe l'integrità funzionale e la capacità di dare colorazione. I cloni corrispondenti appaiono BIANCHI e segnalano la presenza di un clone positivo.

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27 PLASMIDE PBR322 PBR322 é un esempio tipico di vettore di clonaggio. Costruito nel 1977 é stato per molti anni uno dei vettori più utilizzati nei laboratori di ricerca. E' un vettore di piccole dimensioni, presente in circa 20 copie per cellula batterica, con un certo numero di siti unici per enzimi di restrizione. La sua caratteristica più saliente consiste nell'avere due geni di resistenza, uno all'ampicillina e uno alla tetraciclina. Sfruttando i siti di restrizione all'interno di uno dei geni resistenza é possibile clonare un inserto al suo interno e identificare i cloni positivi selezionandoli per la perdita della resistenza corrispondente.

28 Clonaggio di un frammento di DNA in pbr322 all'interno del gene tetr (resistenza alla tetraciclina) utilizzando il sito BamHI. Si digerisce il vettore e l'inserto con l'enzima di restrizione BamHI, quindi si pone l inserto e il vettore in presenza di enzima DNALigasi. Si trasforma il mix di ligazione (PLASMIDE RICOMBINANTE +BATTERIO) (per esempio con cloruro di calcio) in un batterio senza plasmidi e si fanno crescere i batteri in un terreno di crescita solido (in piastra petri) in presenza dell'antibiotico ampicillina. In queste condizioni cresceranno molte cellule batteriche ma non si distingueranno i batteri che contengono il vettore vuoto da quelli che contengono il vettore con l'inserto (ricombinante) La presenza di due geni di resistenza, però permette di replicare tutti i batteri transformanti su una seconda piastra contenente tetraciclina e distinguere i cloni positivi da quelli contenenti il solo vettore. I cloni positivi, infatti, presentano un inserto di DNA inserito nel sito BamHI di pbr322. Questa inserzione interrompe l'integrita' strutturale e funzionale del gene di resistenza permettendo cosi di identificare i cloni positivi come Ap +, Tc -.

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30 PROVA MOLECOLARE DELLA PRESENZA DELL INSERTO. 1. Estrazione del DNA plasmidico dalle cellule trasformate (miniprep- estrazione molto rapida di DNA plasmidico, non puro). 2. Digestione con lo stesso enzima di restrizione utilizzato per la creazione del plasmide ricombinante 3. Verifica della presenza del frammento mediante corsa elettroforetica e utilizzo di marcatori molecolari del DNA.

31 La scelta del vettore di clonaggio dipende dalla grandezza del DNA da clonare: PLASMIDI inserti sino a bp FAGI sino a bp COSMIDI sino a bp BAC sino a bp YAC oltre bp PAC fino a TIPOLOGIE DI VETTORI Vettori di trasformazione: sono molecole di DNA circolari, che si replicano in modo autonomo nei batteri (vengono così amplificati per ottenerne una quantità utilizzabile in laboratorio). La maggior parte sono vettori sintetici, creati in laboratorio assemblando pezzi di interesse a sequenza nota.

32 PLASMIDI Molecole extra-cromosomali di DNA circolare capaci di replicarsi e di segregare autonomamente rispetto al DNA cromosomale batterico. Presenti in natura (batteri, lieviti ) Portatori di geni che arrecano un vantaggio selettivo alla cellula ospite (es.resistenza a un antibiotico) Possono ospitare DNA estraneo (con limiti di grandezza) Possono essere facilmente purificati dal DNA cromosomale del batterio.

33 VETTORI VIRALI I primi utilizzati sono derivati dai batteriofagi λ Prodotti genomi privi dei geni non indispensabili per la replicazione contenenti un sito di restrizione. Inserimento del frammento di DNA esogeno Replicazione del virus all interno della cellula con conseguente replicazione del DNA. I retrovirus possono inserire stabilmente un gene clonato nel genoma della cellula ricevente

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35 Cassetta genica Un gene per esprimersi deve essere convertito ad RNA. Serve quindi una sequenza che «indichi» alla RNA polimerasi, responsabile della trascrizione, DOVE inizia il gene e QUANDO trascriverlo (nel tempo e nello spazio) il PROMOTORE, e una sequenza che indichi alla RNA polimerasi che il gene è terminato (normalmente include un sito di poli-adenilazione, per le sequenze codificanti proteine) il TERMINATORE.

36 VETTORI DI ESPRESSIONE Costruiti per far esprimere in grandi quantità il DNA ricombinante nelle cellule ospiti sia batteriche che eucariotiche (e non solo per clonare). Il gene inserito nel vettore è sotto il controllo di un promotore e di un sito di legame con il ribosoma e sequenze di regolazione che ne permettono la trascrizione. Contengono siti di restrizione vicino ai siti di regolazione che permettono facilmente l inserzione del DNA esogeno. Il sito multiplo di clonaggio si trova tra il promotore e la sequenza di terminazione Un tipico vettore d espressione porta il gene per la proteina fluorescente verde (GFP -Green Fluorescent Protein-) che consente di riconoscere le cellule che presentano il vettore e ne esprimono i geni.

37 Le genoteche o librerie di DNA Libreria genomica: collezione di cloni che include tutto il DNA genomico (frammenti di DNA inseriti singolarmente in un vettore di clonaggio) di una certa specie Libreria di cdna: collezione di cloni che include tutte le specie di mrna (copiate in cdna) espresse in un dato tessuto, incluso quelle piu rare Sono utili per isolare un gene di interesse di cui non si conosce l esatta ubicazione

38 Costruzione di una libreria di cdna Cellule derivate da uno specifico tessuto o stadio dello sviluppo 1) Lisi delle cell. 2) Estrazione RNA 3) Purificaz mrna mrna Trascrittasi inversa Eteroduplex RNA/DNA cdna singolo filamento cdna doppio filamento Aggiunta di linkers con il sito di EcoRI Digestione con EcoRI Ligasi nel vettore e piastratura singoli cloni

39 Vantaggi delle librerie di cdna Dalla sequenza dei cloni si puo derivare direttamente la sequenza della proteina codificata Ogni libreria contiene solo quelle specie di mrna (trascritte in cdna tramite la retrotrascrittasi) che sono espresse in un dato tessuto e in una data condizione

40 SONDE GENICHE (PROBE) Per isolare un singolo cdna si utilizza una sonda Le sonde sono DNA complementari (o RNA) marcati con sostanze radioattive, fluorescenti o con enzimi La lunghezza della sonda va da 10 a basi Si possono generare con tecniche di DNA ricombinante (partendo da mrna CDNA vettore di clonaggio) o sintetizzando oligonucleotidi (gene noto) Hanno proprietà di ibridazione. Rilevazione dell avvenuta ibridazione tramite il Southern blotting o Northern blotting (senza clonare il frammento)

41 Screening di una genoteca Si utilizza una carta da filtro a cui il DNA dei vari cloni aderisce. Il DNA viene denaturato

42 Si immerge questa carta in una soluzione contenente la sonda marcata Screening di una genoteca

43 Screening di una genoteca Il lavaggio elimina tutto ciò che non si è ibridato. Il segnale individua il clone che contiene il gene di interesse

44 Lo screening delle genoteche (genomiche o di cdna) può avvenire in diverse maniere ma soprattutto tramite: - PCR con primers specifici. - Ibridazione con sonde a DNA specifiche. - Tecniche immunologiche

45 Una volta che le colonie o placche siano state identificate, possono venire inoculate in terreno nutritivo liquido per aumentare il numero dei plasmidi o fagi contenenti il vettore e quindi la quantita di DNA ricombinante Successivamente si estrae il DNA del vettore, che contiene il nostro DNA ricombinante di interesse

46 Analisi dei cloni ottenuti Crescita dei cloni, purificazione del DNA plasmidico o fagico e analisi con enzimi di restrizione Sequenziamento Sottoclonaggio

47 Southern blotting e Northern blotting Tecniche per identificare direttamente sequenze geniche di DNA o RNA in una matrice biologica (gel in gel di agarosio) attraverso l ibridazione fra una sonda genica e il DNA da ricercare trasferito su un filtro di nitrocellulosa il DNA o RNA viene digerito con enzimi di restrizione i frammenti vengono separati mediante elettroforesi i frammenti vengono denaturati i frammenti vengono trasferiti da gel al filtro di nitrocellulosa il filtro viene esposto a una sonda genica marcata l ibridazione viene rivelata mediante autoradiografia

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