L ingegneria genetica applicata alla generazione di piante ed animali transgenici

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Luisa Bianchini
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1 L ingegneria genetica applicata alla generazione di piante ed animali transgenici

2 Organismi Transgenici Si dice Transgenico un organismo nel quale sia stata introdotta una sequenza di DNA aggiuntiva (transgene) rispetto a quelle derivate dal patrimonio genetico dei progenitori. Tale DNA potrà essere integrato nel genoma dell organismo stesso oppure, in casi particolari, replicare autonomamente all interno delle cellule (episoma). Tale gene potrà essere presente nel genoma di tutte le cellule dell organismo, comprese le cellule riproduttive, e trasmettersi perciò spontaneamente alle generazioni successive. Potrà al contrario essere presente soltanto nelle cellule di alcuni tessuti dell organismo senza interessare le cellule riproduttive e senza perciò essere trasmesso alla discendenza (transgenesi somatica). Nell accezione più comune del termine si definiscono però transgenici solo gli organismi nei quali il transgene sia integrato nel genoma e trasmissibile alla progenie. Università Cattolica del Sacro Cuore Centro Ricerche Biotecnologiche

3 Aspetti tecnici relativi alla transgenesi nei vegetali Positivi: Possibilità di riprodurre interi organismi partendo da cellule somatiche (clonazione) Rapidità di sviluppo e di ottenimento di un elevato numero di individui discendenti Possibilità di autoimpollinazione (selfing) in alcune specie Negativi: Poliploidia, cioè presenza di copie multiple del corredo cromosomale, in numerose varietà vegetali (essenze erbacee, patate). Da ciò derivano gli effetti di variazione somaclonale. (individui derivanti da cellule di un unico progenitore manifestano caratteri differenti) Struttura cellulare dotata di parete rigida (cellulosa) che rende tecnicamente complessa l introduzione di macromolecole

4 Sviluppo clonale e coltura in vitro di cellule vegetali: Colture da Dischi Fogliari (Leaf Disk) Le cellule somatiche vegetali, almeno in parte, mantengono una elevata potenzialità di sviluppo e differenziamento; Questa potenzialità si manifesta in natura nel processo di riparazione di una lesione con la formazione del callo Le cellule del callo presentano una spiccata tendenza alla proliferazione ma in certe condizioni possono dare luogo alla formazione di radici e foglie fino a generare un nuovo individuo

5 Formazione di Protoplasti Lo sviluppo ed il differenziamento delle cellule vegetali è regolato dai segnali chimici portati da fitormoni. I fitormoni vengono divisi in auxine e citochine in base ai loro effetti. Un elevato rapporto tra auxine e citochine provoca lo sviluppo di radici mentre il rapporto inverso favorisce la formazione di germogli.

6 Tecniche di Transgenesi nei Vegetali. Utilizzo di Agrobacterium spp. Come vettore Vettori virali per la replicazione somatica Transfezione di Protoplasti GeneGun L applicabilità delle diverse tecnologie varia secondo la specie in esame. In generale risulta più semplice operare con piante dicotiledoni (ad. es.: le Leguminose) che con le monocotiledoni ( quali i cereali). Per le prime si possono utilizzare tutte le tecniche riportate, mentre per le monocotiledoni solo l utilizzo di protoplasti e la tecnica che impiega il GeneGun hanno fornito risultati accettabili.

7 Biologia di Agrobacterium tumefaciens

8 Utilizzo di Agrobacterium per la generazione di Piante transgeniche: Cointegrazione

9 Agrobacterium nella generazione di Piante transgeniche

10 Utilizzo di Agrobacterium per la generazione di Piante transgeniche: Sistema Binario

11 Trasferimento genico in vegetali adulti mediante vettori di derivazione virale E possibile sfruttare le proprietà naturali di alcuni virus dei vegetali per consentire il trasferimento di geni in individui adulti Tali sistemi permettono la diffusione del transgene a diverse cellule dell organismo vegetale ed eventualmente alla discendenza La modificazione del vettore virale ne impedisce la diffusione nell ambiente e l effetto fitopatogeno.

12 Trasferimento genico in vegetali mediante sistemi fisici.

13 Trasferimento in protoplasti e ricostituzione di colture da callo Mentre i vettori basati sull Agrobacterium sono efficaci nelle dicotiledoni, essi non risultano efficaci nei monotiledoni. In questo settore un certo successo è stato ottenuto trasformando colture di protoplasti mediante il contatto con una soluzione del DNA di interesse e successiva esposizione ad uno shock elettrico (Elettroporazione) I protoplasti così trattati sono poi coltivati in terreno selettivo per ricostituire nuove piantine transgeniche. Il metodo offre discreti accettabili in specie quali il Mais ed ilriso ma è stato soppiantato da sistemi più semplici ed efficaci quali l impiego del GeneGun

14 Applicazioni del trasferimento genico in campo agricolo. Organismi autorizzati negli USA. C a r a tte r e G e n e tic o O r g a n is m o R ic e v e n te O r g a n is m o D o n a to r e R e s is te n z a a g li In s e tti (B T ) M a is, c o to n e, p a ta ta, p o m o d o ro B a c illu s th u rig e n s is R e s is te n z a a g li e rb ic id i M a is, s o ia, c o to n e, ris o, b a rb a b ie to la d a z u c c h e ro, lin o, c a n o la G e n i a d a tta ti d a ta b a c c o o d a b a tte ri R e s is te n z a a V iru s Z u c c h in i, p a p a y a, p a ta ta V iru s v e g e ta li R a m m o llim e n to ra lle n ta to P o m o d o ro P o m o d o ro, b a tte ri, v iru s C o n te n u to d i a c id i g ra s s i m o d ific a to C o n tro llo d e i p o llin i S o ia, c a n o la S o ia o a ltri v e g e ta li R a d ic c h io, m a is B a tte ri d e l s u o lo

15 I Dubbi circa la sicurezza per il consumatore e per l ambiente. Aspetti di salubrità per il consumatore E possibile che i cibi transgenici risultino tossici? E possibile che i cibi transgenici provochino allergie? E possibile che l ingestione di cibi transgenici portatori di geni per la resistenza agli antibiotici possa diffondere questa caratteristica a microrganismi patogeni? Aspetti ambientali L uso di vegetali resistenti agli erbicidi ne ridurra o ne aumenterà l utilizzo? Questi organismi potranno diffondere le proprie caratteristiche di resistenza alle piante infestanti selvatiche? Potrebbero essere essi stessi delle piante infestanti? L uso ripetuto degli stessi diserbanti potrebber indurre l insorgenza di piante infestanti ad essi resistenti? L utilizzo di Vegetali transgenici ad attività insetticida potrebbe determinare la scomparsa di popolazioni di insetti non nocivi e squilibri dell ecosistema?

16 Tecniche di Introduzione di Transgeni in Organismi Animali Integrazione Random Microiniezione pronucleare Applicabile a molte specie necessita di zigoti Integrazione casuale del transgene Vettori Retrovirali L integrazione avviene nelle cellule in divisione (generazione di mosaici ) Sito di integrazione non prevedibile anche se non del tutto casuale Vettori Lentivirali Integrazione efficiente anche in cellule non in divisione Elettroporazione, vettori liposomali Integrazione casuale alta percentuale di ricombinazione e di inattivazione dei transgeni Sperm-Mediated DNA transport Dopo la prima pubblicazione sono mancate le conferme sperimentali da parte di altri gruppi

17 Sviluppo embrionale

18 Regolazione dell espressione

19 Ruolo del promotore

20 Microiniezione Pronucleare

21 Procedura di microiniezione nel topo

22 Procedura di microiniezione nel topo (2)

23 Microiniezione nel Bovino

24 Esempio di efficienza della tecnica di transgenesi per microiniezione nel bovino Oociti recuperati 2470 Oociti maturati 2297 Oociti fertilizzati 1358 Zigoti microiniettati 1154 Zigoti sopravvissuti 981 Embrioni sviluppati in vitro 687 Embrioni trasferiti (100%) 129 Vitelli nati Vitelli transgenici da Krimpenfort, 1991 (100%) 21 (1.5%) 2 (0,08%)

25 PUNTI CRITICI Efficienza e costi Regolazione e livello di espressione Previsione degli effetti collaterali

26 Ciclo biologico dei retrovirus

27 Vettori Retrovirali

28 Tecniche di Introduzione di Transgeni in Organismi Animali Integrazione Mirata Ricombinazione omologa in E.S.Cells e derivazione di animali chimerici Integrazione mirata del transgene Applicabile soltanto al Topo Nuclear transfer da cellule geneticamente modificate E la tecnica più recente ed appare come la più promettente. Introduzione mirata del transgene. Elevata efficienza. Applicabile a diverse specie di animali domestici

29 Ricombinazione omologa

30 La ricombinazione omologa Gene bersaglio scelto opportunamente oppure inserzione in siti neutrali

31 Iniezione in Blastocisti

32 Gene Targeting 1

33 Gene Targeting 2

34 Le cellule staminali embrionali Limite nelle specie zootecniche: Molto difficili da isolare Chimerismo e lunghi intervalli di generazione

35 Nuclear transfer da cellule embrionali

36 Nuclear Transfer da cellule differenziate

37 Enucleazione e Nuclear Transfer nel topo

38 Enucleazione e Nuclear Transfer

39 Il trapianto nucleare nella pecora : Dolly

40 Il trapianto nucleare Animali clonati: Dolly, Galileo Animali clonati da cellule trasfettate: pecora che esprime il fattore IX umano Animali clonati da cellule trasformate per ricombinazione omologa: ovino e suino. Sono stati clonati bovini da fibroblasti ottenuti da biopsia e coltivati in vitro per lunghi periodi (30 divisioni)

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