Ingegneria genetica nelle piante

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1 PAS Percorsi Abilitanti Speciali Classe di abilitazione A057 Scienza degli alimenti Tracciabilità genetica degli alimenti Ingegneria genetica nelle piante 1

2 Struttura del DNA

3 Flusso dell informazione genetica

4 Promotore eucariotico elemento (scatola: box) sequenza posizione TATA TATAAA -30 CAAT GGCCAATCT -80 GC GGGCGG da -100 Paolo Edomi - Genetica 4

5 Il codice genetico 4 nucleotidi 43 = 64 1 tripletta 1 aminoacido 20 aminoacidi Paolo Edomi - Genetica 5

6 Definizione funzionale di gene un gene è una sequenza di DNA che codifica per un polipeptide (o un RNA) 1 gene : Edomi 1 polipeptide Paolo - Genetica 6

7 Struttura dei geni e mrna eucariotici GENE 5 ESONE 1 INTRONE 1 ESONE 2 INTRONE 2 ESONE 3 3 TRASCRITTO mrna struttura del gene funzione del gene 5 UTR ORF 3 UTR Paolo Edomi - Genetica 7

8 Vettori plasmidici

9 Enzimi di restrizione

10 Ligazione

11 Clonaggio

12 Trasformazione batterica

13 Ricombinazione omologa o generalizzata: crossing-over non omologa o integrativa: trasposizione

14 Clonaggio per ricombinazione

15 Clonaggio nelle piante finalità proprietà resistenza consumo piante transgeniche (transgene) capacità di rigenerazione (vs cell animali) trasformazione in planta (embrioni, semi, polline)

16 Tipologie di clonaggio 3 tipi vettori basati su plasmidi di Agrobacterium trasferimento diretto vettori virali

17 Agrobacterium tumefaciens plasmide tumorigenico Ti batterio del suolo crown gall dicotiledoni

18 Ciclo di Agrobacerium

19 Plasmide Ti e T-DNA plasmide Ti 200 kb geni infettivi geni tumorali (T-DNA) T-DNA (23 kb): integrazione per ricombinazione non-omologa geni per tumore (citochina, auxina) opine: derivati degli aa, vantaggio selettivo per Agrobatteri sequenze confine: integrazione stabile geni virulenza vir ori

20 Plasmide Ti come vettore plasmide Ti come vettore rimozione geni tumorali dal T-DNA inserto tra regioni confine problema: grandezza (siti, manipolazione) 2 strategie vettori co-integrazione vettori binari

21 Vettori di co-integrazione ricombinazione tra plasmide (di clonaggio) e plasmide Ti in Agrobacterium

22 Vettori binari T-DNA modificato per clonaggio + plasmide Ti senza T-DNA

23 Selezione di plasmidi Ti resistenza ad antibiotici (kanamicina) resistenza ad erbicidi (csr-1 di Arabidopsis, acetolattato sintetasi) incubazione di tessuto fogliare con Agrobacterium ricombinante (lesioni nel prelievo) selezione in terreno con citochine (crescita), ampicillina (eliminazione dei batteri), kanamicina (piante trasformate)

24 Trasformazione con Agrobacterium

25 Problemi nell'uso di Agrobacterium monocotiledoni resistenti (lignificazione delle lesioni) utilizzo di sostanze chimiche o embrioni (divisione cellulare agevola integrazione) espressione promotori forti (35S CaMV) promotori tessuto specifici (semi) effetto di posizione numero di copie (silenziamento del transgene)

26 Trasformazione diretta

27 Trasformazione biolistica particelle di metallo (oro, tungsteno) rivestite di DNA e sparate (gene-gun) nelle cellule (gas ad alta P, scariche elettriche) destino complesso del DNA: inserzione casuale in copie multiple

28 Trasformazione di protoplasti senza parete (trattamento con pectinasi e enzimi che degradano la cellulosa) ricrescita 10gg trasformati per trattamento chimico, elettroporazione o con liposomi integrazione e selezione con marcatori

29 Vettori virali Virus del mosaico del cavolfiore: DNA circolare, ds, 8kb, 8 geni limite all'impaccamento (8,3 kb): inserto da 1 kb intermedio a RNA (errori di replicazione) poche specie Geminivirus: DNA ss, replica ds ma: riarrangiamenti, delezioni Virus del mosaico del tabacco genoma a RNA

30 Ingegnerizzazione di cloroplasti genoma plastidico: circolare, ds, geni in operoni, policistroni poliploidi, migliaia di cloroplasti: alti livelli di espressione non nel polline inserzione per ricombinazione omologa: regioni di omologia di almeno 400 bp promotori e terminatori cloroplasto-specifici

31 Selezione di cloroplasti trasformati aada: resistenza alla spectinomicina (inibitore della sintesi proteica in batteri e cloroplasti) kanamicina: questione del trasferimento orizzontale BADH (betaina aldeide deidrogenasi): trasforma la aldeide betaina (tossica) in glicin-betaina (innocua) rimozione di marcatori con Cre-lox

32 Trasformazione di cloroplasti metodi biolistici (per la doppia membrana) induzione dell'omoplasmia

33 Manipolazione di cloroplasti ampio utilizzo resistenza a erbicidi, insetti, siccità produzione di farmaci produzione in piante commestibili forma attiva della proteina espressione di più geni (operoni) incrocio di piante transgeniche diverse 3 geni di Bt

34 Piante transgeniche

35 Ingegneria genetica nelle piante aggiunta di un gene sottrazione di un gene

36 Resistenza a insetti: Bt OGM per gene cry di Bacillus thuringiensis cristalli citoplasmatici solubili solo nell'intestino (ph 9,5) di larve di lepidotteri

37 La proteina Cry di Bt pro-tossina deltaendotossina, 60 kda: squilibrio ionico, lisi cellulare, ph minore e sporulazione uso in campo

38 Il caso del mais CryIA(b) trasformazione di embrioni mediante biolistica

39 Il caso del tabacco CryIIA(a2) effetto anche su ditteri trasformazione di cloroplasti 45% delle proteine totali

40 Resistenza a erbicidi glifosolato: inibitore della sintesi di aa aromatici blocca la EPSPSasi 1) sovraespressione della EPSPSasi 2) EPSPSasi mutata piante Roundup ready ma: eccesso di erbicidi

41 Alternativa alle piante roundup ready B. licheniformis

42 La tecnologia antisenso

43 Maturazione ritardata pomodori: molti geni implicati poligalacturonasi (della parte cellulare del pericarpo): rende soffice la parete ritardare azione dell'enzima: maturazione più lenta utilizzo di sequenze antisenso al 5' sotto controllo del promotore 35S del CamV in Agrobacterium: riduzione del 6%

44 Pomodori OGM FlavrSavr

45 Resistenza a virus principio della resistenza alla sovrainfezione espressione di proteine del virus impedisce l'infezione ma: altri virus possono ancora infettare

46 Resistenza a funghi espressione di proteine anti-fungine es: piante di tabacco esprimenti la chitinasi del fagiolo sotto promoteore 35S del CaMV crescono in presenza del fungo Rhizoctonia solani, in quanto la chitinasi idrolizza la chitina della parete cellulare del fungo

47 La tecnologia terminator inibizione della sintesi proteica per inattivazione dei ribosomi piante normali, semi sterili