Targetting delle proteine ai plastidi

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1 Targetting delle proteine ai plastidi Nella trasformazione da endosimbionte ad organello, molti geni sono stati trasferiti dal genoma plastidiale al genoma nucleare Molte proteine codificate da geni trasferiti al nucleo continuano a svolgere funzioni importanti nei plastidi Proteine codificate dal genoma nucleare e sintetizzate nel citoplasma devono tornare all interno dei plastidi Trasferimento di geni Nucleo Endosimbionte/ Cloroplasto Targetting di proteine

2 Molti complessi proteici plastidiali sono chimerici formati da proteine codificate da geni nucleari e plastidiali Esempi: - Componenti della fase luminosa - RUBISCO

3 Numero variabile di membrane da attraversare Targeting al cloroplasto Possibili siti bersaglio: Membrane (Int. / Ext.) dell involucro periplastidiale Spazio periplastidiale Stroma Membrana tilacoidale Lume tilacoidale lume tilacoidale Spazio periplastidiale stroma

4 Proteine destinate al reticolo endoplasmatico, al mitocondrio o ai plastidi mostrano alcuni meccanismi conservati Meccanismo co-traduzionale Meccanismo co-traduzionale Reticolo endoplasmatico Meccanismo posttraduzionale Meccanismo post-traduzionale Mitocondri Plastidi Conserved translocation themes. (A) Either chaperones (red) or occupancy of the C-terminal region of nascent chains in the ribosomal exit tunnel (blue) prevents premature stable folding of preproteins. Membrane-bound receptors (green) bind preproteins and transfer them into the translocon (purple), which can conduct them across the bilayer or release apolar regions laterally into the bilayer. Motors and chaperones (yellow) on the trans surface of the membrane complete the transport task. (B) Cotranslational translocation into the ER. (C) Mitochondrial protein import. OM, outer membrane, IMS, intermembrane space, IM, inner membrane. (D) Chloroplast protein import

5 Componenti del sistema TIC/TOC (Translocon at the Inner/Outer envelope membrane of Chloroplast) Un peptide di transito determina la destinazione della proteina allo stroma Sequenza amminoacidica ricca di aa basici.

6 Proteine destinate allo stroma hanno solo il peptide di transito La Ribulosio Bisfosfato Carbossilasi/Ossigenasi (Rubisco) è l enzima chiave della fase oscura Enzima formato da 16 (8+8) subunità Subunità piccola Subunità grande gene nucleare gene plastidiale Costituisce 50% delle proteine plastidiali

7 Il meccanismo di attraversamento dell involucro esterno di mitocondri e plastidi è molto simile Meccanismo post-traduzionale Presequenza Peptide di transito Mitocondrio Cloroplasto

8 Nonostante le forti somiglianze, non c è omologia tra i sistemi di trasferimento delle proteine mitocondriali (TIM/TOM) e plastidiali (TIC/TOC) Come fanno gli organismi che hanno mitocondri e cloroplasti a discriminare tra le proteine destinate ai due diversi comparti? Nelle piante, TOM22 (recettore per la presequenza e componente del canale di traslocazione) ha perso la funzione di recettore per la presequenza

9 Targeting ai comparti interni del cloroplasto Molte proteine plastidiali sono destinate ai TILACOIDI o al LUME TILACOIDALE (es. Plastocianina) Sono necessari sistemi di riconoscimento aggiuntivi al peptide di transito per attraversare la membrana tilacoidale Diversi sistemi di traslocazione Omologie con sistemi di secrezione batterica Sistema Sec (ATP dipendente) Sistema Tat ( ph dipendente) Sistema SRP-dipendente

10 Trasformazione Genetica del Genoma Plastidiale La TRANSPLANTOMICA ha molti aspetti vantaggiosi Confronto del genoma plastidiale di diverse specie vegetali

11 Vantaggi della trasformazione del genoma plastidiale rispetto alla trasformazione del genoma nucleare: A Numero di copie del transgene Livello di espressione Riduzione della eventuale tossicità della PR Plastidi Nucleo N Vacuolo plastidi/cellula nucleoidi/plastide 5-10 genomi/nucleoide ~ genomi/cellula!

12 Vantaggi della trasformazione del genoma plastidiale rispetto alla trasformazione del genoma nucleare: B Organizzazione del genoma Non c è effetto posizione (Ricombinazione Omologa) Non c è silenziamento genico Modifiche post-traduzionali (S-S) - Annullamento dei problemi legati al fenomeno del silencing A variegated petunia. Upon injection of the gene responsible for purple colouring in petunias (chalcone synthase), the flowers became variegated or white rather than deeper purple as was expected.

13 B. L organizzazione in operoni permette di inserire 1 o più geni contemporaneamente

14 I cloroplasti nelle piante di interesse agrario vengono trasmessi per via uniparentale materna I fiori sono solitamente ermafroditi I plastidi nei gameti maschili degenerano durante la fecondazione

15 Vantaggi della trasformazione del genoma plastidiale rispetto alla trasformazione del genoma nucleare: C Omogeneità delle linee transgeniche Contenimento genico Omogeneità delle linee transgeniche 100% dei semi F1 contengono il transgene (non c è segregazione Mendeliana) Contenimento genico Viene impedita la dispersione del transgene attraverso il polline

16 Confronto tra trasformazione nucleare e plastidiale

17 Svantaggi della trasformazione plastidiale: Nella trasformazione plastidiale non può essere usato Agrobacterium, che trasferisce DNA esclusivamente al nucleo Deve essere utilizzato necessariamente il metodo balistico, che ha una efficienza di trasformazione molto bassa Con il metodo balistico si possono trasformare solo alcuni dei numerosi cloroplasti nella cellula N Vacuolo

18 Dopo la trasformazione balistica, le cellule devono essere sottoposte a diversi cicli di selezione per arricchire la popolazione di plastidi trasformati Condizione eteroplasmica Condizione omoplasmica

19 I costrutti per la trasformazione plastidiale sono di tipo procariotico Sviluppo di marcatori di selezione alternativi agli antibiotici Betaina aldeide CH 3 O CH 3 N + CH 2 C H CH 3 NAD + NADH Betaina aldeide deidrogenasi BADH Glicina Betaina CH 3 O CH 3 N + CH 2 C OH CH 3 La betaina aldeide è un composto tossico Alcune piante possiedono l enzima per trasformarlo in un composto atossico (glicina betaina)

20 In alternativa, eliminazione dei marcatori di selezione su antibiotici dal genoma plastidiale Sostituzione con altri marcatori di selezione (es. resistenza ad erbicidi) Due diversi protocolli per eliminare un marcatore di resistenza alla spectinomicina e sostituirlo con resistenza ad erbicidi

21 Esperimenti in campo con piante transplastomiche 2008