Promotori ed elementi di regolazione

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1 Promotori ed elementi di regolazione

2 Elementi cis- e trans- per la regolazione dell espressione genica Cis-acting elements Sequenze di DNA nella vicinanza della regione codificante di un gene che sono necessarie per l espressione genica Trans-acting factors fattori, di solito proteine, che si legano agli elementi cis- per il controllo dell espressione genica

3 Struttura e organizzazione di un gene eucariotico

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5 Elementi comuni presenti in quasi tutti i promotori: CAAT box. Una sequenza consenso vicino a -80 bp dal punto di inizio della trascrizione (+1). Aumenta la forza del promotore; sembra funzionare in entrambi gli orientamenti. Nelle piante questo box è rimpiazzato da una sequnza consenso chiamata AGGA box. E il sito di legame del fattore di trascrizione CTF/NF1; Muller, et al Eur. J. Biochem. 176:485 TATA box. Sequenza di solito localizzata intorno a 25 bp a monte del sito di inizio della trascrizione. In genere tende ad essere circondata da sequenze ricche in GC. E il sito di legame per l RNA polimerasi II e una serie di fattori di trascrizione (TFIIX, dove X è una lettera che indica uno specifico fattore di trascrizione) che formano il complesso di inizio; il primo di questi è il TFIID; Workman & Roeder, Cell 51:613 GC box. Un sequenza ricca in G e C, di solito è presente in copie multiple, normalmente intorno al TATA Box. E il sito di legame del fattore di trascrizione SP1; Anderson & Freytag, Mol. Cel. Biol. 11:1935 CAP site. Sequenza di inizio della trascrizione definito +1, in cui il processo di trascrizione inizia.

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7 Struttura del complesso di trascrizione dell RNA polimerasi II e sequenza di assemblaggio

8 Le tre principali categorie dei fattori di trascrizione

9 Gli attivatori modulano a distanza la regolazione genica

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11 Introni, attivatori (Enhancer) e regioni di attacco (Attached regions) Queste regioni contribuiscono a regolare l espressione genica. Possono costituire delle porzioni aggiuntive di DNA nel costrutto da utilizzare nella trasformazione genetica di tessuti vegetali per aumentare, modulare o stabilizzare l espressione genica. Ad esempio le regioni MAR o SAR (Sito di attacco alla matrice, Matrix attachment regions o sito di attacco all impalcatura, Scaffold attachment Regions) vengono utilizzate per stabilizzare l espressione genica soprattutto nel caso di trasformazioni genetiche effettuate con il metodo biolistico, dove il numero di copie può essere elevato. MAR o SAR: Regione del DNA che si attacca alla matrice nucleare. Matrice nucleare: Rete di fibre che circonda il nucleo e penetra al suo interno.

12 Nuclear scaffold e MAR

13 Regioni MAR (regioni di attacco alla matrice) possono regolare l espressione genica

14 Analisi dei promotori, identificazione degli elementi cis- e loro analisi funzionale

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18 Identificazione di elementi promotori funzionali mediante analisi footprinting

19 Footprinting: es. Determinazione del sito di legame del repressore lac

20 Espressione con i geni reporter GUS GFP

21 Saggio GUS (b-glucuronidasi) Si esegue 2-3 giorni dopo la trasformazione del tessuto Il tessuto sottoposto a trasformazione viene immerso per ore in una soluzione contenente 5-Bromo-4-Cloro-3- indolil-b-d-acido glucuronico (X-gluc). L eventuale attività enzimatica viene evidenziata nel tessuto intatto come delle macchie blu.

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24 Vantaggi: Semplicità di esecuzione e non necessità di apparecchiature particolari. Può essere anche quantitativo. In tal caso si quantifica l attività GUS mediante saggio fluorometrico usando come substrato il 4- metilumbelliferil b-d-glucuronide (MUG). Questa analisi implica l estrazione dell enzima e la successiva analisi dell attività GUS. Comunque il vantaggio principale risiede nella semplicità del saggio istochimico. Svantaggi: La colorazione istochimica causa la morte del tessuto.

25 Saggio GFP E forse il gene reporter attualmente più utilizzato La GFP è una proteina di 238 amminoacidi della medusa Aequorea victoria.

26 I componenti richiesti per la bioluminescenza dell equorea victoria includono: Equorina, una fotoproteina attivata dal Ca++ che emette luce blu-verde Green Fluorescent Protein (GFP), una proteina fluorescente verde, che accetta energia dall equorina e la riemette come luce verde.

27 La fluorescenza intrinseca della GFP è dovuta a 3 amminoacidi (Ser-65-Tyr-66-Gly-67) che ciclizzano formando un cromoforo che ha due massimi di eccitazione: con luce UV (396 nm) luce blu (475 nm). I massimi di emissione della luce sono rispettivamente a 508 e 503 nm.

28 Sono state prodotte diverse versioni modificate della GFP in modo da renderla più adatta come reporter. Una delle modificazioni più efficaci ha riguardato la sostituzione della Ser-65 con una Thr. La GFP S65T possiede: un solo picco massimo di eccitazione alla luce blu un più forte segnale fluorescente rispetto alla proteina nativa, rendendo più semplice il suo rilevamento.

29 Localizzazione apoplastica della proteina di fusione BjEXPA1::GFP in cellule epidermiche di cipolla

30 Geni Reporter- sommario Saggi transienti per l espressione genica I geni reporter sono geni che codificano per proteine facilmente saggiabili. Sono utilizzati da soli o in combinazione con altre regioni codificanti il cui prodotto proteico è difficile da saggiare (proteine di fusione) I più comuni geni reporter sono: GFP (green fluorescent protein): Emissione fluorescente dopo eccitazione (rilevamento in situ mediante i sistemi DIANA, LAS o FLA). GUS (b-glucuronidasi): idrolizza glucuronodi incolori producendo un prodotto colorato.

31 Utilizzo dei geni reporter per: Attività regolativa di una sequenza di DNA GUS GUS GUS GUS

32 Utilizzo dei geni reporter per: Determinazione della Forza dei Promotori Attività di alcuni promotori in saggi transienti con GFP

33 Utilizzo dei geni reporter per: Determinazione della tessuto-specificità Es: Espressione nello stigma e nel tessuto vascolare del gene Pvpgip1

34 Utilizzo dei geni reporter per: Scelta del tessuto per la trasformazione Embrioni immaturi Dischi fogliari Meristemi apicali

35 Utilizzo dei geni reporter per: Scelta delle condizioni per la trasformazione

36 Tipi di promotori Promotori costitutivi Promotori tessuto specifici o stadio di sviluppo specifici Promotori inducibili Promotori sintetici

37 Promotori costitutivi

38 Promotore 35S del Virus del Mosaico del Cavolfiore (CaMV 35S) Subdomain A: corrisponde al promotore minimo Subdomain B: -208 to -46 corrisponde ad una regione enhancer Può essere usato nella combinazione 35S duplicato, per una maggiore espressione

39 Promotore dell Ubiquitina di mais (Ubi-1)

40 Jones et al Options mediterraneennes 81

41 Promotori tessuto-specifici

42 Esempi di promotori tessuto specifici brevettati Es: Dx5-Promotore delle glutenine ad alto peso molecolare

43 Radici Foglie Glume Jones et al Options mediterraneennes 81

44 Promotori inducibili

45 Sono indotti in seguito alla presenza o assenza di specifici fattori biotici o abiotici I geni sotto il controllo di questi promotori possono essere attivati o disattivati a specifici stadi di sviluppo o in specifici tessuti Esempio di promotori indotti da fattori chimici o fisici Promotori regolati da fattori chimici: alcool, tetraciclina, steroidi, metalli ed altri composti Promotori regolati da fattori fisici: luce e temperatura

46 Caratteristiche ideali di un sistema chimico-inducibile in pianta Livello di espressione costitutivo basso Alta inducibilità Elevata specificità rispetto all induttore Elevata variabilità di risposta rispetto alle concentrazioni dell induttore Risposta rapida dopo l induzione Rapido silenziamento in seguito alla rimozione dell induttore Induttore non tossico e privo di effetti fisiologici sulla pianta Induttore assente nelle piante bersaglio

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49 Sistema di espressione indotto dall etanolo

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51 Anche il ferimento meccanico può indurre una specifica espressione genica

52 Pathogenesis-related gene promoters

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54 Promotori sintetici

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57 Promotori maggiormente usati nella trasformazione di piante coltivate Promotore 35S dal virus del mosaico del cavolfiore (CaMV) nos 5 : regione regolatrice del gene della nopalina sintetasi (NOS) dal T-DNA di Agrobacterium tumefaciens Promotore dell ubiquitina di mais (Ubi ) Promotore endosperma specifico: gluteline riso e glutenine frumento

58 Esempio di applicazione di specifici promotori

59 Tecnologia Terminator Chrispeels e Sadava: Genetica, Biotecnologie e Agricoltura Sostenibile. Idelson- Gnocchi. Box 9.2 pag. 261 Questa tecnologia consiste nell uso di una serie di interrutori molecolari che possono essere attivati nelle piante transgeniche per uccidere l embrione e impedire così la germinazione dei semi transgenici. Molecole coinvolte Gene I: Ricombinasi Enzima che riconosce un tratto specifico di DNA lo rimuove e riunisce le due estremità di taglio Gene II: Inibitore della ricombinasi sotto il controllo di un promotore reprimibile

60 Gene III: Tossina La proteina codificata da questo gene è letale per l embrione ed è sotto il controllo di un promotore tardivo (late promoter, LP) che è attivo soltanto nelle fasi finali dello sviluppo dell embrione Blocker : segmento di DNA posto tra il promotore e la regione codificante della tossina composto da sequenze riconosciute dalla ricombinasi. La presenza del blocker interferisce con la capacità del promotore di regolare l espressione del gene per la tossina Induttore: Sostanza con la quale la Ditta Sementiera tratta i semi transgenici

61 Gene Ricombinasi Promotore reprimibile Gene Inibitore Promotore tardivo Blocker Gene Letale

62 Meccanismo di funzionamento Gene Ricombinasi Gene Inibitore Promotore trardivo Blocker Gene Letale Nei semi non trattati con l induttore Gene Ricombinasi Gene Inibitore Gene Letale Nei semi trattatti con l induttore Tossina