PROTEINE RICOMBINANTI

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Annibale Salvatore
8 anni fa
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1 PROTEINE RICOMBINANTI

2 PROTEINE RICOMBINANTI

3 TRASFORMAZIONE IN LIEVITO

4 VETTORI SHUTTLE

7 PROTEINE RICOMBINANTI

8 Colture cellulari = propagazioni di cellule fuori dall organismo vantaggi: 1) l ambiente extracellulare puo essere manipolato 2) uso di un tipo cellulare ben definito 3) grandi quantita di cellule 4) studio di varie funzioni cellulari Due tipi di colture cellulari: 1) colture primarie 2) linee cellulari

9 Colture primarie cellule derivate direttamente da un tessuto Tecnica messa a punto nel 1907: 1 g Espianto di midollo spinale + Fluido linfatico Cellule con assoni che si sviluppano in coltura! Numero di divisioni limitato senescenza replicativa

10 Neuroni in vitro con prolungamenti

11 Linee cellulari Possono derivare da varie fonti: cellule trasformate in vitro (p.e. espressione di oncogene) espianti tumorali (posti in coltura crescono indefinatamente)

13 differentiating muscle cell line = C2C12

15 Vettore di espressione per cellule animali in coltura

16 Piccolo introne

17 G418 - GENETICIN Blocca la traduzione in tutti gli organismi

18 LIPOFEZIONE Si utilizzano liposomi caricati con i vettori di espressione

19 BACULOVIRUS Virus che infetta le larve di insetto Il promotore virale della poliedrina è molto potente! Virioni appena formati

20 DOMANDA FREQUENTE: QUALE E LA FUNZIONE DI UNA CERTA PROTEINA? OVERESPRESSIONE DELLA PROTEINA ESPRESSIONE ECTOPICA CON UN VETTORE DI ESPRESSIONE ABOLIZIONE DELLA ESPRESSIONE DELLA PROTEINA INTERFERENZA A RNA (RNAi) SI AUMENTA O SI DIMINUISCE L ESPRESSIONE DELLA PROTEINA ALLA RICERCA DI EVENTUALI VARIAZIONI FENOTIPICHE!

21 sirna Possibilità di modulare negativamente l espressione di specifici geni Somministrazione sperimentale di sirna FORTE RIDUZIONE DELL ESPRESSIONE DELLA PROTEINA

22 PROTEINE TERAPEUTICHE RICOMBINANTI DI PRIMA GENERAZIONE Proteine identiche a quelle naturali INSULINA ERITOPOIETINA G-CSF FATTORI ANTIEMOFILICI VACCINI RICOMBINANTI DI SECONDA GENERAZIONE Proteine che sono state manipolate (muteine) p.e. tpa, insulina ecc. VACCINI RICOMBINANTI ANTICORPI

25 SIERI BOVINI O EQUINI Immunoglobuline da sieri di animali immunizzati con uno specifico antigene Siero antitetanico: animali trattati con la tossina del batterio Clostridium tetani

27 Cellule tumorali (linfoma) immortale IBRIDOMA immortale

29 Mouse Chimeric Humanized

30 Catena Leggera Catena Pesante

34 ANTICORPI IN TERAPIA Blocco di interazioni ligando-recettore (p.e. estrogeni) Blocco di funzioni proteiche (p.e. oncogeni) Stimolo di segnalazione intracellulare (p.e. apoptosi) (sia anticorpi interi che frammenti) Reclutamento di componenti del sistema immunitario a seguito del binding (stimolo immunità cellulare) (anticorpi interi)

39 MODELLI ANIMALI OVERESPRESSIONE DI UNA PROTEINA NORMALE O ESPRESSIONE DI UNA VERSIONE MUTATA (p.e. proto-oncogene attivato) Trasfezione di cellule in coltura Animali transgenici ABOLIZIONE DELL ESPRESSIONE DI UNA PROTEINA (p.e. malattie genetiche, oncosoppressori) RNAi in colture cellulari o in C.elegans Topi knock out MODELLI PER RICERCHE DI BASE MODELLI PER MALATTIE UMANE

40 ANIMALI TRANSGENICI POSSIBILI APPLICAZIONI PRODUTTIVE espressione di proteine ricombinanti nel latte di mammiferi (capre, bovini) Vettore con promotore tessuto-specifico per la ghiandola mammaria (CASEINA)

41 BLASTOCISTI TRASFEZIONE

42 Creazione del costrutto per la ricombinazione omologa Cellule ES Staminali embrionali: anipolazione in vitro (trasfezione) Inserimento nella blastocisti Topi chimerici 1 incrocio per genotipo -/+ 2 incrocio per genotipo -/-

43 RICOMBINAZIONE OMOLOGA Distruzione (interruzione) del gene bersaglio TRASCRIZIONE Inattiva attiva

44 Resistenza al G418

45 INCROCIO TRA CHIMERICO E BIANCO I TOPI NERI SONO ETEROZIGOTI KO ED ETEROZIGOTI B/N ( B recessivo ) 25% -/- B/N +/- 50% +/- 25% +/+ B/N +/-

46 INCROCIO TRA CHIMERICO E BIANCO I TOPI NERI SONO ETEROZIGOTI KO ED ETEROZIGOTI B/N ( B recessivo ) H = -

47 TECNICHE BIOCHIMICHE Western blot con IgG specifiche ANALISI DEL FENOTIPO ANALISI IMMUNOISTOCHIMICA con IgG specifiche

48 PROMOTORE DI VIRUS VEGETALE PIANTE TRANSGENICHE

49 CLONAGGIO DI ANIMALI Non è una tecnologia del DNA ricombinante

50 RIASSUMENDO

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