TRASFERIMENTO GENICO IN CELLULE ANIMALI

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1 TRASFERIMENTO GENICO IN CELLULE ANIMALI

2 Perché manipolare geneticamente le cellule animali Per lo studio funzionale di geni e proteine tipici degli organismi animali Per la produzione di proteine con modificazioni posttraduzionali che i batteri e i lieviti non sono in grado di effettuare Per applicazioni in terapia genica Per la produzione di animali transgenici

3 Cellule animali in coltura Cellule primarie: derivano direttamente da tessuti espiantati da un organismo e sono in grado di dividersi da 10 fino a 50 volte prima di andare incontro a fenomeni di senescenza e morte. Sono caratterizzate da inibizione da contatto e dipendenza dall ancoraggio Cellule immortalizzate: possono crescere in maniera indefinita in coltura se vengono diluite e nutrite in maniera appropriata Cellule trasformate: crescono in maniera indefinita, in pluristrato, spesso non richiedono la presenza di fattori di crescita serici, possono proliferare in sospensione e, se iniettate in animali da laboratorio, possono dare origine a tumori

4 Mezzi di crescita per cellule di mammifero Le cellule animali sono molto più difficili da far crescere in coltura dei microorganismi perchè necessitano di molte più sostanze nutritive e crescono solo se attaccate a superfici rivestite in maniera appropriata. Un tipico mezzo di coltura per cellule di mammifero contiene: Amminoacidi Glucosio Vitamine: Biotina, Colina, Folato, Riboflavina, ecc. Sali: NaCl, KCl, NaH 2 PO 4, NaHCO 3, CaCl 2, MgCl 2 Antibiotici: Pennicilina, Streptomicina Siero: 5-10% del volume totale (spesso siero bovino fetale, più ricco di fattori di crescita) Fattori di crescita: diversi da quelli presenti nel siero

5 Terminologia Introduzione di DNA in: o Batteri o Eucarioti o Virus -mediata trasformazione trasfezione trasduzione/infezione

6 Tecniche di trasferimento genico in cellule eucariotiche Trasferimento diretto (microiniezione) Trasfezione (metodi chimici e fisici) Trasduzione (virus) Trasfezione transiente Trasfezione stabile

7 Trasfezione transiente Se il DNA esogeno trasfettato all interno della cellula non viene integrato nel genoma della cellula ospite e non contiene un origine di replicazione per cellule animali, la cellula sarà in grado di mantenere il DNA esogeno solo per un periodo di tempo limitato, prima di degradarlo o di perderlo durante le divisioni cellulari Efficieza di trasfezione transiente: molto alta Metodologia semplice, utile per esperimenti di breve tempo con cellule in coltura Trasfezione stabile Il DNA esogeno trasfettato all interno della cellula viene mantenuto in maniera stabile e propagato alle cellule figlie. La trasfezione stabile può essere ottenuta in due modi: Introduzione del DNA esogeno in vettori contenenti repliconi Integrazione del DNA esogeno nel genoma della cellula ospite L efficieza dell integrazione è molto bassa pertanto le cellule trasfettate stabilmente vanno selezionate Tecnica idonea per esperimenti a lungo termine

8 Iniezione diretta Efficienza del 100% Numero limitato di cellule da trasfettare per ogni singolo esperimento Utilizzata per cellule grandi (es.: ovociti di Xenopus) e per generare animali transgenici Trasfezione stabile

9 Metodi di Trasfezione Metodo basato sulla precipitazione: CaPO 4, DEAE-destrano Sostanze Lipofiliche (neutre e cationiche) Meccanici: Elettroporazione e Gene-gun

10 Coprecipitazione con calcio fosfato CARATTERISTICHE DEL METODO Bassa efficienza di trasfezione (~20%) Il DNA trasfettato spesso si integra nel genoma (trasfezione stabile) Applicabile solo a cellule che crescono in monostrato I granuli di calcio fosfato associati al DNA entrano nella cellula per endocitosi e vengono poi trasportati al nucleo

11 Trasfezione con DEAE-destrano Il Dietilamino-etil destrano è un carboidrato policationico, idrosolubile, che favorisce l interazione tra il DNA esogeno e il macchinario endocitotico della cellula CARATTERISTICHE DEL METODO Trasfezione transiente Funziona bene anche con quantità piccole di DNA

12 Liposomi I liposomi sono vescicole fosfolipidiche di origine sintetica. I lipidi possono essere neutri o carichi positivamente Il DNA entra nelle cellule in seguito alla fusione delle vescicole con la membrana plasmatica delle cellule da trasfettare CARATTERISTICHE DELLA LIPOFEZIONE Trasfezione sia stabile che transiente Elevata efficienza di trasfezione Metodo delicato utile quando si lavora con frammenti di DNA di grandi dimensioni Speranze di utilizzare tale metodologia per la terapia genica. Sono in atto tentativi di sviluppare liposomi cellulo-specifici

13 Elettroporazione Efficienze di trasfezione alta con molti tipi cellulari Facile da eseguire se si ha a disposizione l apparecchiatura idonea Trasfezione stabile L intesità e la durata dell impulso vanno stabiliti empiricamente in base al tipo cellulare da trasfettare cuvette cuvette 0.4cm

14 Gene Gun Microscopiche particelle di metallo vengono ricoperte di DNA e poi sparate nelle cellule tramite un gas ad alta pressione CARATTERISTICHE DEL METODO Può essere utilizzato anche su interi organismi Utilizzato per la trasformazione delle piante

15 Marcatori selezionabili per le cellule animali MARCATORI ENDOGENI: Tk, Ada, Aprt, Cad, Hprt Cotrasformazione del DNA si interesse con un marcatore endogeno. I marcatori endogeni sono geni coinvolti in vie metaboliche (in genere di nucleotidi), pertanto si utilizza la capacità di complementare il difetto nutrizionale di una certa linea cellulare per riconoscere le cellule trasfettate. Lo svantaggio di tale metodo è che bisogna trasfettare necessariamente linee cellulari mutate nel gene utilizzato come marcatore di selezione. MARCATORI DI SELEZIONE DOMINANTI: neo, hyg, pac, ble, gpt Sono geni che conferiscono alle cellule trasfettate un fenotipo nuovo. Si tratta di solito di geni di origine batterica i cui prodotti rendono la cellula trasfettata resistente a determinati farmaci. La selezione va eseguita crescendo le cellule in un terreno contenente la giusta concentrazione di tali farmaci.

16 Sistemi di espressione utilizzati in cellule animali Cotrasfezione Vettori plasmidici non replicativi Sono costrutti di espressione che permettono la trasfezione transiente poiché sono privi di un origine di replicazione attiva in cellule animali. Sono utili per l analisi della funzione di sequenze regolative e per la produzione di piccole quantità di proteina ricombinante. Non richiedono la selezione delle cellule trasfettate. Vettori plasmidici con repliconi virali Repliconi di SV40 (espressione transiente) Repliconi del virus del papilloma bovino (BPV) (espressione stabile) Repliconi del virus di Epstein-Barr (EBV) (espressione stabile) Vettori virali di trasduzione Adenovirus Virus adenoassociati (AAV) Herpes virus Retrovirus

17 Vettori plasmidici non replicativi Promotori forti costitutivi in grado di guidare l espressione del gene esogeno in molti tipi cellulari: promotori virali derivati dai geni dei virus SV40, cytomegalovirus, adenovirus e virus del sarcoma di Rous Promotori inducibili: il sistema Tet Promotori tessuto-specifici Enhancers Segnali di poliadenilazione Segnali di terminazione della trascrizione Segnali per la traduzione Marcatori di selezione Segnali di targeting Vettore non replicativo. Il marcatore di selezione è il gene neo (Tn5) trascritto sotto il controllo della regione LTR del virus del sarcoma di Rous

18 La biologia del virus SV40 SV40 è un virus tumorale di scimmia. Infezione litica con produzione di migliaia di particelle virali Capside icosaedrico Genoma : DNA circolare a doppio filamento lungo 5243 bp Trascritti precoci: T antigen grande e T antigen piccolo Trascritti tardivi: proteine del capside Enhancer Origine di replicazione

19 Vettori plasmidici contenenti repliconi: SV40 come sistema di espressione transiente I geni virali possono essere sostituiti da DNA esogeno e l infezione va eseguita con 1) virus helper 2) in cellule COS, cellule di scimmia che contengono nel loro genoma la regione codificante l antigene T grande che forniscono in trans la proteina antigene T grande necessaria per la replicazione Replicone di SV40 SV40 è utilizzato sia in esperimenti di trasduzione sia come replicone come sistema di espressione transiente per la produzione di elevate quantità di proteina ricombinante

20 Vettori plasmidici contenenti repliconi: BPV ed EBV come vettori episomici per l espressione l stabile Il genoma virale di questi virus viene mantenuto come replicone a basso o medio numero di copie senza interferire con la crescita della cellula ospite. I plasmidi che contengono le origini di replicazione derivate da questi virus si comportano allo stesso modo e sono pertanto ottimi vettori episomici che permettono un espressione stabile della proteina ricombinante senza l integrazione del gene esogeno nel genoma della cellula ospite Vettori derivati dal virus del papilloma bovino: copie per cellula. Vettori derivati dal virus di Epstein-Barr: contengono due regioni del genoma virale, orip e il gene che codifica per una proteina di regolazione tran-attivante detta antigene nucleare 1 di Epstein-Barr (EBNA 1). Permettono il clonaggio di frammenti di DNA di grandi dimensioni. Utilizzati per la creazione di genoteche di cdna episomici per il clonaggio di espressione

21 Vettori virali di trasduzione Importanti per il trasferimento genico in vivo in terapia genica Adenovirus Virus adenoassociati (AAV) Herpes virus Retrovirus Competenti per la replicazione o indipendenti dall helper Difettivi per la replicazione o dipendenti dall helper Scelta del vettore virale Caratteristiche del virus Tipo di cellula ospite Dimensione del gene da trasferire Necessità di espressione stabile o transiente

22 Vettori adenovirali 36 kb Il gene esogeno viene inserito nel genoma in sostituzione dei geni precoci E1-E4 che vengono forniti in trans Vantaggi Possibilità di trasfettare sia cellule in divisione che cellule quiescenti Raramente si integrano nel genoma della cellula ospite Alti livelli di espressione transiente Molto utilizzati in terapia genica per l efficacia con cui entrano nelle cellule in vivo Svantaggi Espressione solo transiente Rischio di risposta infiammatoria in terapia genica

23 I Retrovirus Nel capside è presente il genoma, costituito da due molecole identiche di RNA di circa 10 kb, la trascrittasi inversa e l integrasi. Infezione: interazione con la cellula bersaglio mediata dalle proteine virali dell involucro lipoproteico. Nella cellula l RNA viene convertito in DNA a doppio filamento lineare che viene integrato nel genoma della cellula ospite dall integrasi. Dopo l integrazione il genoma del virus viene trascritto e le proteine virali vengono prodotte. Si assemblano le particelle virali che fuoriescono dalla cellula per gemmazione senza provocare la morte della cellula.

24 Il genoma dei retrovirus Dopo l integrazione Prima dell integrazione Le LTR (Long Terminal Repeats) si formano in seguito all integrazione del genoma virale nella cellula ospite Gag codifica per le proteine del capside Pol codifica per la trascrittasi inversa e l integrasi Env codifica per le proteine di superficie dell involucro lipoproteico L impacchettamento nel capside richiede la sequenza di impaccamento Ψ

25 Vettori retrovirali I vettori retrovirali sono quasi sempre difettivi nella replicazione. Gli unici elementi in cis richiesti per il processo replicativo e per l impaccamento sono: le LTR, necessarie per l integrazione, la trascrizione e la poliadenilazione dell RNA la sequenza di impaccamento Ψ i siti di legame per i primer necessari per la replicazione del virus Il vettore virale contenente queste tre sequenze, il gene esogeno e il marcatore di selezione viene trasfettato in una linea cellulare che fornisce le in trans la trascrittasi inversa e le altre proteine strutturali. I virus così prodotti vengono utilizzati per infettare le cellule bersaglio dove il genoma virale ricombinante si integrarà e gene esogeno potrà essere espresso.

26 Caratteristiche dei vettori retrovirali Si integrano nel genoma della cellula ospite Non uccidono la cellula infettata Presenza di promotori forti Piccolo genoma facile da manipolare Ampio spettro d ospite (solo cellule proliferanti)