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10 Cromosoma del batterio donatore Trasferimento della ORF nel vettore di espressione PRODUZIONE DELLA PROTEINA RICOMBINANTE Abbondante e facilmente purificabile

11 Contiene una ORF continua!! 5 NT non tradotto 3 NT Retrotrascrizione in cdna

12 PURIFICAZIONE DELLA FRAZIONE polya+ Catene di oligo dt legate alla matrice

13 Si generano estremità piatte

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15 TESSUTO O COLTURA CELLULARE mrna COSTRUZIONE DI UNA LIBRARY DI cdna cdna Inserimento nel vettore Trasformazione in cellule batteriche SCREENING

16 PIASTRA PETRI DA 10 cm

17 Fosforilazione al 5 OH i deossi-oligonucleotidi sintetici hanno sempre il 5 con solo un OH

18 Nitrocellulosa trattata con NaOH: Lisi delle cellule batteriche Legame covalente del DNA al supporto Denaturazione del DNA 1. Ibridazione in liquido 2. Lavaggi 3. Autoradiografia

19 ds cdna sonde degenerate Denaturazione (NaOH) e ibridazione Fosforilazione al 5 OH i deossi-oligonucleotidi sintetici hanno sempre il 5 con solo un OH

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21 C 8h 12h 15h Proteina ricombinante

22 Biofarmaci o Farmaci proteici In un primo tempo solo come farmaci che replicano la funzione. La loro attività è uguale a quella naturale. Le proprietà farmacologiche non sono migliorate rispetto al prodotto naturale

23 PROTEINE TERAPEUTICHE RICOMBINANTI DI PRIMA GENERAZIONE Proteine identiche a quelle naturali INSULINA ERITOPOIETINA G-CSF FATTORI ANTIEMOFILICI VACCINI RICOMBINANTI DI SECONDA GENERAZIONE Proteine che sono state manipolate (muteine) VACCINI RICOMBINANTI tpa INSULINA ANTICORPI

24 L INSULINA E UNA PROTEINA DI SECREZIONE Sequenza (o peptide) segnale Sequenza di inizio della traslocazione al RER Peptide segnale che verrà prontamente digerito dalla peptide-segnalepeptidasi

25 Pre-proinsulin: per la secrezione dal pancreas è presente anche il peptide segnale all N-terminale Il peptide segnale Si perde dopo l entrata nel RER

26 Espressione di INSULINA UMANA ricombinante in batteri

27 Aggiunta di un peptide segnale per facilitare la purificazione (proteina nel sopranatante ) Purificazione del r-hgh dal terreno di coltura (dopo centrifugazione) Ormone della crescita umano hgh

28 PROTEINE DI SECREZIONE IN BATTERI Prima la SINTESI e poi la SECREZIONE Taglio del peptide segnale

29 CREAZIONE DI PROTEINE IBRIDE CON L AGGIUNTA DI SPECIFICI DOMINI PROTEICI PROTEINE DI FUSIONE

30 PROTEINE TERAPEUTICHE RICOMBINANTI DI PRIMA GENERAZIONE Proteine identiche a quelle naturali INSULINA ERITOPOIETINA G-CSF FATTORI ANTIEMOFILICI VACCINI RICOMBINANTI DI SECONDA GENERAZIONE Proteine che sono state manipolate (muteine) VACCINI RICOMBINANTI tpa INSULINA ANTICORPI

31 Azione della Pol I In vitro si usa il frammento di Klenow

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33 MUTAGENESI SITO-SPECIFICA Oligonucleotide-diretta

34 MUTAGENESI SITO-SPECIFICA Oligonucleotide-diretta DUPLICAZIONE SEMI-CONSERVATIVA

35 Codice genetico Ridondante (degenerato) Codoni sinonomi Non ambiguo Universale (quasi!) Letto in direzione 5 3 Produce polipeptide in direzione NH2 - COOH Senza punteggiatura Un mrna ha un solo frame di lettura (determinato da AUG)

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37 Mutagenesi oligonucleotide-diretta INSULINA INSULINA Lys-Pro: inversione in posizioni 28 e 29 oppure mutazione Pro/Asp maggiore solubilità e minore formazione di polimeri. Altre mutazioni per causare precipitazione a ph neutro dopo iniezione per un rilascio graduale Insulina per via orale

38 Mutagenesi oligonucleotide-diretta ATTIVATORE TISSUTALE DEL PLASMINOGENO VACCINO PER LA PERTOSSE

39 MUTAGENESI SITO-SPECIFICA Utilità nella ricerca di base Utilità a fini applicativi

40 TNF - Tumor Necrosis Factor Induttore della via estrinseca della apoptosi (recettori di morte) Regolatore del sistema immunitario Citochina prodotta dai macrofagi, con un ruolo chiave nella regolazione della risposta infiammatoria Elevati livelli ematici presenti in condizioni patologiche (artrite reumatoide, spondilite anchilosante, inflammatory bowel disease / Crohn s disease) Farmaci che ne bloccano l azione sono utili nel controllo di tali patologie

41 DOMINANTI NEGATIVI TNF TNF TRIMERO DEL RECETTORE del TNF TNF Mutato Dominante negativo Un trimero recettoriale si forma e si attiva interagento con tre molecole di TNF

42 Vaccino ricombinante per la pertosse ADP-ribosilasi Tossina attiva Enzima inattivo Proteina non tossica

43 Tossicità mediata da ADP-ribosilazione di proteine G ADP-ribosilazione NAD +

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45 CONCENTRAZIONE DI ANTICORPI SPECIFICI NEL SIERO