I RECETTORI: Caratterizzazione e isolamento
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- Flavia Colucci
- 9 anni fa
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1 I RECETTORI: Caratterizzazione e isolamento Andrea Ferrigno Funzione dei recettori di membrana Secrezione dell ormone nel sangue L ormone è trasportato attraverso il circolo sanguigno L ormone raggiunge le cellule target
2 Funzione dei recettori di membrana activated/ inhibited Caratteristiche dei recettori Interazione debole (reversibilità) Alta affinità Specificità del legame Specificità dell effetto
3 Approcci allo studio dei recettori Clonazione Studio del legame con il ligando (curve dose-effetto) Determinazione della struttura tridimensionale Individuazione (studi di binding) Purificazione Sviluppo di nuovi farmaci Studio del meccanismo d azione Sequenziamento Studio del legame recettore-ligando Obiettivi: Studio dell attività intrinseca Determinazione EC 50 (potenza) Determinazione K d (efficacia)
4 Tecniche per lo studio del legame recettore-ligando CAMPIONI: Sezioni di tessuto Cellule isolate Colture cellulari Membrane isolate Recettori isolati TECNICHE: Dialisi all equilibrio Scintillazione Spettroscopia in fluorescenza Citometria a flusso Microarray di proteine Tecniche in fluorescenza Spettroscopia in fluorescenza Citometria a flusso Microarray di proteine Ligando Marcatore fluorescente La fluorescenza vira da verde a rosso Recettore Recettore marcato Complesso ligando/recettore
5 Distribuzione e localizzazione dei recettori Studi sulla schizofrenia: autoradiografia di encefalo umano marcato con [3H]MDL: distribuzione e localizzazione dei recettori 5HT2A. Isolamento e purificazione di recettori Isolamento dell organo Omogenazione Trattamento con detergenti L organo elettrico della torpedine è ricco di recettori dell acetilcolina Il veleno dei cobra è ricco di a- bungarotossina, antagonista del recettore dell acetilcolina
6 Tecniche di purificazione: la cromatografia di affinità miscela di proteine contentente il recettore ligando covalentemente legato a sfere di polistirene recettore purificato Sequenziamento dei recettori proteici La degradazione di Edman in quattro passi: 1) PITC si lega all estremità N-terminale 2) Liberazione del derivato PITC/aminoacido (PTH) 3) Identificazione del PTH mediante HPLC 4) Si ripete dal punto 1) fino all idrolisi della proteina intera Sequenziatore automatizzato
7 Determinazione della struttura tridimensionale Dalla densità elettronica al modello atomico Sequenza aminoacidica + dati di diffrazione Modello atomico del recettore
8 Recettori ricombinanti: il perché Le tecniche classiche di isolamento dei recettori sono vincolate all esistenza di casi eccezionali. L organo elettrico della torpedine è ricco di recettori dell acetilcolina Il veleno dei cobra è ricco di a- bungarotossina, antagonista del recettore dell acetilcolina Recettori ricombinanti: il come 1) Estrazione di tutti gli mrna da cellule che esprimono anche il recettore di interesse 2) Gli mrna sono enzimaticamente convertiti in cdna e inseriti in plasmidi di espressione 3) I plasmidi di espressione sono trasfettati in cellule batteriche 4) Le cellule che contengono il DNA esprimono il recettore e lo espongono sulla membrana 5) Le cellule che esprimono il recettore sono distinte dalle altre grazie a un ligando selettivo, marcato con sostanze radioattive o fluorescenti
9 Plasmide contenente il cdna di una proteina irrilevante Recettori ricombinanti: riepilogo Plasmide contenente il cdna del recettore di interesse Le cellule che non contengono il cdna di interesse non esprimono il recettore e non sono ricunosciute dal ligando marcato Le cellule contenenti il cdna di interesse esprimono il recettore Il ligando marcato riconosce il recettore Le cellule di interesse sono rivelate mediante radioattività o flurescenza Approcci allo studio dei recettori Clonazione Studio del legame con il ligando (curve dose-effetto) Determinazione della struttura tridimensionale Individuazione (studi di binding) Purificazione Sviluppo di nuovi farmaci Studio del meccanismo d azione Sequenziamento
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