cromatografia Esplorando le proteine

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1 Cromatografia Flavia Frabetti Tecnici di laboratorio 2010/2011 Esplorando le proteine Un passaggio indispensabile negli studi di biochimica che necessitano di conoscere la sequenza aa di una proteina per potere spiegare la sua struttura tridimensionale e dunque il suo funzionamento è la PURIFICAZIONE della proteina di interesse Tre metodi chiave: cromatografia elettroforesi ultracentrifugazione 1

2 CROMATOGRAFIA metodo fisico di separazione dei componenti di una miscela complessa può essere analitica o preparativa di solito per arrivare alla purificazione completa di una sostanza si deve usare una sequenza di più metodi cromatografici il fondamento di tutte le tecniche cromatografiche è il coefficiente di ripartizione (o coefficiente di distribuzione) Kd che descrive come il composto si distribuisce tra due fasi immiscibili. si realizza attraverso l utilizzo di un sistema cromatografico fase impaccata in un letto cromatografico fase mobile sistema di distribuzione della fase mobile sistema di rilevazione I singoli componenti di una miscela vengono separati sulla base di differenti CARATTERISTICHE FISICHE: dimensione e forma carica volatilità solubilità affinità di legame per molecole specifiche la separazione dei singoli componenti di una miscela è resa possibile dalla diversa interazione degli stessi con la fase interazione forte interazione scarsa ritardo maggiore ritardo minimo tempi di eluizione > tempi di eluizione < 2

3 Lessico scientifico Eluire = lavare via, staccare via, distaccare una sostanza dalla fase alla quale ha aderito per una specifica affinità Fase = componente del sistema caratterizzato da una uniforme composizione chimica e proprietà fisiche (densità, struttura cristallina, ecc.) miscela fase fase mobile rilevatore Si inietta una miscela da analizzare su una colonna I componenti avanzano a diverse velocità attraverso il mezzo di conduzione ovvero la fase mobile, a seconda del grado di affinità per la fase, il tempo di uscita verrà registrato dal rilevatore 3

4 Tipologie dei sistemi cromatografici La classificazione può avvenire in base a: forma del letto cromatografico metodo di separazione natura delle fasi mobile o Tipologiaclassificazione Forma del letto cromatografico es. su strato sottile (es.carta) o su colonna Cromatografia su CARTA colonna contenente la fase caricamento campione aggiunta solvente Cromatografia su STRATO SOTTILE raccolta dei componenti 4

5 Tipologiaclassificazione Metodo di separazione 1) cromatografia di partizione o ripartizione separazione sulla base della solubilità di molecole piccole ripartizione tra due fasi liquide: acqua che permea una matrice solida inerte + fase mobile organica non polare cromatografia a fase inversa (vedi HPLC): la fase non polare matrice inerte di supporto fase molecole non polari che si sciolgono nella fase flusso della fase mobile molecole polari che passano velocemente attraverso la colonna Metodo di separazione 2) cromatografia per gel permeazione (o esclusione molecolare) separazione sulla base della dimensione fase = granuli porosi di un polimero insolubile ma molto idratato molecole piccole che hanno accesso all intera matrice molecole medie che hanno accesso solo ai pori più larghi fase gel microporoso molecole grandi che sono totalmente escluse dai pori e passano rapidamente attraverso la colonna flusso della fase mobile 5

6 Metodo di separazione 3) cromatografia a scambio ionico separazione sulla base della carica fase = colonne con resine: cariche + (es.dietilamminoetilcellulosa o DEAEcellulosa) oppure cariche (es.carbossimetilcellulosa o CMcellulosa) fase resina a scambio cationico flusso della fase mobile cationi (+) del campione che vengono trattenuti dalla colonna Separazione di aa in una colonna a scambio cationico Colonna a scambio cationico Asp Ser Lys 6

7 Metodo di separazione 4) cromatografia per affinità separazione sulla base ad una affinità chimica di legame fase = colonne dove viene immobilizzato un ligando specifico per una certa molecola che ha una struttura complementare che specificamente riconosce quel ligando fase : matrice solida di supporto tratto spaziatore ligando molecola complementare legata da interazioni specifiche al ligando flusso della fase mobile tutti gli altri soluti vengono eluiti Tipologiaclassificazione fase : solido/gel o liquido Natura delle fasi mobile o fase mobile: liquido o gas Tipo es. Gascromatografia Cromatografia (LC) Cromatografia su strato sottile (TLC) Cromatografia a Scambio ionico (IEC) Fase Solida o solida solida Fase mobile gas 7

8 Tipologiaclassificazione fase : solido/gel o liquido Natura delle fasi mobile o esempi: fase mobile: liquido o gas cromatografia : HPLC cromatografia ad alta performance o cromatografia ad alta pressione pompa rilevatore colonna Fase solida cromatografia gas : gascromatografia carrier gas Esempio di un cromatogramma Deve avere una buona risoluzione 8

9 t R2 t M t R1 Δt inizio picco di un soluto non trattenuto W b1 W b2 t R = tempo di ritenzione t M = tempo di ritardo della fase mobile t R1 = t R t M Δt = distanza tra i 2 picchi RISOLUZIONE R= Δt W b1 +W b2 2 se R = 1.5 separazione completa 9