Tecniche di estrazione-preconcentrazione

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1 Tecniche di estrazione-preconcentrazione Spazio di testa statico (HS) Spazio di testa dinamico (purge & trap)(pat) Estrazione in fase solida (SPE) Micro-estrazione in fase solida (SPME) 1

2 ESTRAZIONE SU FASE SOLIDA (SPE) Processo di estrazione che coinvolge un liquido ed una fase solida L obbiettivo è: ritenere l analita sulla fase solida o eluirlo rapidamente SPE B C Approccio più utilizzato A) Il campione passa attraverso un piccolo volume di fase stazionaria solida impaccata in una cartuccia. B) Il soluto è trattenuto, le interferenze passano attraverso la fase o sono successivamente lavate via. C) Il soluto viene eluito dalla fase utilizzando un piccolo volume di solvente. A B A) Il campione passa attraverso un piccolo volume di fase stazionaria solida impaccata in una cartuccia. B) Il soluto passa non trattenuto attraverso la fase. 2

3 Principi Questa procedura si basa sugli stessi principi della ritenzione in cromatografia liquida, cioè: l adsorbimento l affinità l esclusione molecolare lo scambio ionico La tecnica si adatta quindi al recupero di microcomponenti di polarità bassa, media ed elevata in funzione del tipo di adsorbente utilizzato. 3

4 Rappresentazione del meccanismo di Adsorbimento" Fase mobile (liquido o gas) Fase stazionaria * * *** * ** ti attivi La fase stazionaria deve contenere dei siti attivi capaci di dar luogo ad interazioni con il soluto che portano ad un suo adsorbimento. Tali interazioni sono del tipo: - Legami idrogeno - Interazioni dipolo-dipolo - Forze di Van der Waals Rappresentazione del meccanismo di Scambio ionico (esempio di resina a scambio anionico). La fase stazionaria è costituita da: c) matrice polimerica (es copolimero stirene-divinilbenzene) su cui sono legati dei gruppi-funzionali b)dotati di carica elettrica a) portanti il controione. L anione (campione) presente nella fase mobile sostituisce uno dei controioni della resina. Facendo passare il controione originario in elevata concentrazione o un diverso anione più affine al gruppo funzionale si ottiene lo spostamento dello ione campione. 4

5 Rappresentazione del meccanismo di Esclusione molecolare Molecole del campione Fase stazionaria (granuli di gel) Fase mobile La fase stazionaria è un solido poroso o un gel (idrofilo) caratterizzato da pori di dimensioni variabili, scelte a seconda del tipo di molecole da separare. Nella cromatografia di esclusione, i componenti di un campione vengono separati in base alle dimensioni delle molecole. Le molecole di piccole dimensioni sono rallentate perché penetrano all interno dei pori della fase stazionaria e ne restano intrappolate per la maggior parte del tempo. Le molecole che hanno dimensioni significativamente maggiori della dimensione media dei pori dell impaccamento ne restano escluse e non subiscono alcuna ritenzione; ossia esse viaggiano attraverso la colonna alla velocità della fase mobile. Rappresentazione del meccanismo di Affinità 1) La fase stazionaria è costituita da una matrice insolubile a cui è covalentemente legato un adatto ligando. 2) Nel passaggio della miscela, si legano all adsorbente solo le molecole con un sito di legame specifico per il ligando; le altre fluiscono via. 3) Durante l eluizione (con una fase mobile diversa) invece, gli analiti si staccano dalla colonna e si raccolgono le molecole che erano rimaste legate. 5

6 Riassumendo sfrutta la distribuzione dell analita tra una fase liquida S (liq.), ed una fase solida (S) insolubile nella soluzione con la quale è posta a contatto. S (liq.) S Il campione in soluzione è fatto fluire attraverso una colonna impaccata con un adsorbente solido. Dopo il contatto per un tempo opportuno, il soluto, che è rimasto ancorato alla fase solida, può essere recuperato utilizzando piccoli volumi di un opportuna soluzione estraente. 6

7 L'estrazione in fase solida (SPE) è una tecnica di preparazione del campione usata per isolare (purificazione) e/o per concentrare (arricchimento) gli analiti di interesse. L'ampia scelta di fasi adsorbenti e delle dimensioni delle colonnine rende possibile ottimizzare tale tecnica in funzione del problema specifico dell'utilizzatore. Risulta essere un efficiente metodo di preconcentrazione necessario per i metodi analitici in tracce; adatto a tutti i tipi di campione; riduce il consumo di solventi (minore nocività per l operatore, minori costi per lo smaltimento); migliora l efficienza, produce un campione; relativamente pulito in quanto praticamente scevro da interferenti, adatto per l analisi in TLC, GC e in HPLC; possibilità di rigenerazione e quindi di riutilizzo della fase solida; possibilità di automazione. 7

8 Colonnine preconfezionate per estrazioni SPE Contenitori in polipropilene o in teflon (tetrafluoroetilene -se è richiesto un rilascio di composti organici pari a zero) a forma di siringa (tipo usato in ambito sanitario) con setti porosi per trattenere il materiale adsorbente. Serbatoio del campione Setto vetro poroso Setto vetro poroso Estraente in fase solida Materiale adsorbente di varia natura di solito: Quantità: mg o 1 g Dimensioni particelle: µm 8

9 Sequenza delle operazioni per l SPE Solvente di condizionamento es: (a) (b) La colonna viene lavata, cioè condizionata, con lo stesso solvente che verrà utilizzato per eluire l analita impiegando un volume corrispondente a 5-10 volte il volume della fase stazionaria. L'analita + matrice viene caricato in colonna con un solvente appropriato (a basso potere eluente) incapace, cioè, di far eluire dalla colonna gran parte dei componenti il campione. 9

10 (c) (d) (e) La colonna viene lavata con uno o più solventi che faranno eluire le impurezze lasciando l'analita in colonna (o VICEVERSA). Questo passaggio richiede una buona conoscenza delle proprietà chimicofisiche dell'analita, della matrice e dell'adsorbente. L'analita viene eluito con una piccola quantità di un appropriato solvente. Riassumendo 10

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12 Fattori principali che influenzano la selettività dell isolamento dell analita Tipo di materiale (FASE) che costituisce l impaccamento della cartuccia Questo parametro è quello che maggiormente influenza la selettività e l efficienza della separazione. Composizione della fase mobile Miglioramento di selettività limitato: - dal potere eluente del solvente - dalla solubilità della sostanza da determinare. Velocità di flusso Una velocità di flusso TROPPO ELEVATA non lascia tempo sufficiente al raggiungimento dell'equilibrio tra la fase estraente e il solvente che scorre attraverso essa. Il solvente, quindi potrebbe passare attraverso la matrice senza entrare in contatto con l'intera sua superficie. Capacità di carico degli adsorbenti pari generalmente all' 1-5 % della loro massa (per una cartuccia di 100 mg la capacità è pari a 1-5 mg). Matrici del campione sporche potrebbero comportare una riduzione della capacità di carico per il campione nei gel non selettivi. Ad esempio se per estrarre un campione da una matrice contenente grandi quantità di materiali lipofili utilizziamo una quantità di gel ottadecile piccola, la capacità del gel potrebbe essere superata. 12

13 PRINCIPALI ADSORBENTI UTILIZZATI IN SPE ADSORBENTI NATURALI (Carbone ed Allumina) NERI di CARBONE GRAFITATO (Graphitized Carbon Black) (GCB) RESINE POLIMERICHE GEL DI SILICE e GEL DI SILICE MODIFICATI GEL di IMMUNOAFFINITA POLIMERI A STAMPO MOLECOLARE (Molecularly Imprinted Polymers - MIPs) Nei gel di silice modificati (derivatizzati) si distinguono le seguenti fasi: - A SUPERFICIE POLARE (SPE a FASE DIRETTA O NORMALE ) - A SUPERFICIE APOLARE (SPE a FASE INVERSA) - CON SITI CARICHI (SPE a SCAMBIO IONICO) I materiali attualmente in uso sono a fase chimicamente legata al supporto di gel di silice. 13

14 GEL DI SILICE MODIFICATI A SUPERFICIE POLARE (SPE A FASE DIRETTA O NORMALE ) Questi gel di silice trattengono gli analiti attraverso interazioni tra gruppi polari. Fasi polari con gruppi NH 2, adsorbono composti organici con gruppi funzionali acidi e basici. Il lavaggio della colonna viene spesso effettuato con un solvente organico di modesta polarità, come il cloruro di metilene privo di alcol. I composti polari sono quindi eluiti con metanolo o miscele di metanolo e tampone acido (per i composti basici) o metanolo e tampone basico (per i composti acidi). 5-Fluorouracile Fenilefrina 14

15 GEL DI SILICE MODIFICATI A SUPERFICIE APOLARE (SPE A FASE INVERSA) La fase desiderata viene legata ai gruppi reattivi silanolici (-OH) della silice per reazione con un silano contenente un gruppo reattivo (es. cloro). L atomo di silicio è legato alla molecola della fase desiderata (qui mostrata OH OH OH come C 18 o octadecil) e a due piccoli gruppi laterali come il metile. SUPPORTO SILICEO H 3 C Cl CH 3 OH OH OH H 3C CH 3 H 3C O OH OH CH 3 O H 3C OH CH O 3 Molti dei silanoli superficiali non reagiscono a causa dell ingombro sterico. I silanoli che non reagiscono sono spesso chiamati silanoli liberi. Questo fenomeno è tanto più rilevante quanto maggiore è l ingombro del legante(es. C18). 15

16 DISATTIVAZIONE DELLA SILICE (END-CAPPING) I silanoli liberi sono disponibili per altre interazioni con le molecole di soluto, spesso indesiderate (sono causa dei picchi scodati). Viene quindi spesso effettuato un processo di end-capping utilizzando un silano di piccole dimensioni che si lega ai silanoli liberi. Piccoli silani come il trimetilclorosilano sono in grado di accedere a molti dei silanoli liberi rimasti dopo il legame della fase stazionaria. Il processo di end-capping rende i silanoli inaccessibili alle molecole di soluto. CH 3 CH3 Cl CH 3 H 3C CH 3 H 3C O OH OH CH 3 O H 3C OH CH O 3 I gel di silice lipofili trattengono i composti apolari o poco polari purché essi siano nella forma non ionizzata, attraverso interazioni di van der Waals 16

17 FASI NON COMPLETAMENTE RIVESTITE: È possibile comprare dei gel di silice a fase inversa con un alto grado di derivatizzazione in cui la maggior parte dei residui silanolici è stata bloccata. Potrebbe, a volte, anche essere preferibile sfruttare l'insieme delle proprietà lipofile ed adsorbenti di fasi inverse che non siano stati derivatizzati in modo spinto (endcapped). In queste ultime ci sono in superficie, dei gruppi silanolici polari ancora liberi. Nel caso delle ammine potrebbe verificarsi un tipo di interazione polare con i gruppi silanolici non derivatizzati sulla superficie dei gel di silice lipofili Quanto più è ridotta la lunghezza della catena alchilica sulla superficie del gel di silice tanto più è probabile che anche l'adsorbimento rivesta un ruolo nell'estrazione. Colonne SPE non-polari Le colonnine SPE con meccanismo di ritenzione non polare sono usate soprattutto per estrazioni di composti organici da matrici acquose. I prodotti non-endcapped presentano interazioni secondarie che li rendono particolarmente indicati per estrazioni di composti basici o altri analiti polari da matrici acquose. I prodotti endcapped sono indicati per applicazioni dove le interazioni secondarie con i gruppi silanolici non sono richieste 17

18 GEL DI SILICE MODIFICATI - CON SITI CARICHI (SPE a SCAMBIO IONICO) Con questi gel di silice si hanno Interazioni di scambio ionico tra analiti con gruppi carchi (-) o (+) e gruppi funzionali di segno opposto dell adsorbente. Dimetilaminopropil Aminopropil Solfonilfenilpropil Carbossipropil 18

19 GEL di IMMUNOAFFINITA Adsorbenti di AFFINITA sono costituiti da LIGANDI immobilizzati solitamente su polisaccaridi quali ad es. cellulosa, agarosio o agarosioacrilammide, che hanno un'elevata affinità per un particolare analita. In tale ambito, si sfrutta ad esempio il legame selettivo tra: un enzima e il suo substrato ormoni e recettori antigeni e anticorpi (in questo caso si usa il termine immunoaffinità). Le braccia a forma di Y si legano in modo altamente specifico all analita GEL di IMMUNOAFFINITA Nel caso di gel di immunoaffinità è stata indotta la produzione di anticorpi per un particolare analita; tali immunoglobuline sono poi legate alla superficie di una matrice SPE. Vari tipi di manipolazione chimica permettono questo tipo di immobilizzazione e la SPE, nonché la cromatografia di affinità, si è ben affermata in ambito biochimico. Le braccia a forma di Y si legano in modo altamente specifico all analita 19

20 POLIMERI A STAMPO MOLECOLARE (Molecularly Imprinted Polymers - MIPs) I polimeri a stampo molecolare (MIPs) sono resine sintetiche altamente ramificate che presentano al loro interno siti selettivi per il riconoscimento molecolare. Vengono sintetizzati in modo abbastanza semplice lasciando polimerizzare i monomeri funzionali in presenza di una molecola modello per la quale i componenti del polimero hanno una certa affinità e che agisce da stampo. Quando il modello viene rimosso, sul polimero rimane impressa la forma della molecola modello e di eventuali gruppi funzionali ad essi legati che sono in grado di legare le molecole bersaglio, composti con struttura uguale o molto simile a quella usata come stampo. Il comportamento di questi polimeri è simile a quello degli anticorpi, per questo sono anche definiti anticorpi sintetici. il polimero lega di preferenza la molecola modello originale. 20

21 VANTAGGI possono essere rigenerati e riutilizzati senza diminuire le proprie capacità anche dopo un uso prolungato; possibilità di analizzare un carico maggiore di campione grazie all elevata densità dei siti di legame, di alcuni ordini di grandezza superiore a quella degli anticorpi usati come immuno-adsorbenti; i siti di legame incorporati nella matrice solida sono in grado di resistere in condizioni ambientali anche molto difficili (temperature e pressioni elevate, soluzioni non acquose e ph estremi). possibilità di ottenere un maggior recupero di analiti, di abbassare i limiti di rilevamento, l elevata stabilità, la maggiore selettività, la possibilità di lavorare con solventi organici e il basso costo di produzione, rendono questo approccio molto promettente rispetto agli attuali protocolli per SPE. Separazione di Teofillina e Caffeina mediante una colonna SPE contenente un polimero con l impronta della teofillina. La caffeina viene eluita insieme al solvente CHCl 3 L aggiunta di un piccolo volume di CH 3 OH al solvente causa la rottura dei ponti idrogeno tra teofillina e il polimero e fa eluire la teofillina. 1,3,7-trimetilxantina 1,3-dimetilxantina Anche gli isomeri ottici possono essere separati facendoli passare attraverso un polimero a stampo molecolare per il quale si è impiegato come molecola modello uno degli isomeri ottici. 21

22 ADATTAMENTO DELLA SPE ALLA AUTOMATIZZAZIONE per l esecuzione di estrazioni in parallelo CONDIZIONI SPERIMENTALI: SPE DI IPA Adsorbente in fase solida Aspirazione Soluzione del campione COLLETTORE DA VUOTO SOLVENTE DI CONDIZIONAMENTO E DI ESTRAZIONE: Cicloesano per HPLC CARTUCCIA ADSORBENTE: Florisil (MgO O 2 H 2 0) Adattamento della SPE alle tecniche di estrazione automatizzata on-line a monte dell'analisi HPLC Gli elementi essenziali del sistema sono i seguenti: (i) Un solvente di bassa forza trasporta il campione (linea 1) e fa in modo che esso sia trattenuto alla testa di una colonna estrattiva di preconcentrazione. Questa colonna potrebbe essere non polare, laddove sia richiesta la rimozione di impurezze polari prima della cromatografia o polare, se invece è necessaria la rimozione di sostanze lipofile. Le sostanze indesiderate fuoriuscitie dalla colonna vanno allo scarico (linea 1) 22

23 (ii) Il campione viene recuperato dalla colonna di estrazione utilizzando per il flusso di ritorno lo stesso solvente che era stato usato per caricarlo, in tal modo finisce intrappolato alla testa della colonna cromatografica (linea 2) (iii) Il campione viene eluito con la fase mobile HPLC (linea 3) Membrane SPE Membrane SPE, per campioni di acqua di grandi dimensioni (superiori a 10 L) si possono usare membrane la cui fase adsorbente è costituita da politetrafluoroetilene (PTFE) legato con silice e altre resine in un filtro di 0,5 mm di spessore. La membrana a forma di disco sottile è montata all interno di una struttura di plastica fissata sulla punta di una siringa. Per eseguire l estrazione si costringe la soluzione che si trova all interno della siringa a passare attraverso la membrana. 23

24 Vantaggi Estrazione in fase solida (SPE) rispetto all'estrazione liquido/liquido Rapida preparazione del campione. Elevato recupero di analiti senza formazione di emulsioni. Sebbene i recuperi siano generalmente buoni, in questo tipo di analisi probabilmente è preferibile utilizzare uno standard interno per valutare (e quindi compensare il dato analitico) le eventuali perdite per assorbimento irreversibile nel mezzo di estrazione. La fase solida è immiscibile con i solventi e perciò, dopo aver caricato il campione, può essere utilizzata tutta una serie di condizioni di lavaggio per rimuovere i componenti interferenti, avendo a disposizione un'ampia gamma di solventi di lavaggio. La natura chimica dell'adsorbente può essere variata in modo tale che esso sia selettivo per un particolare gruppo funzionale dell'analita. Un campione diluito in un grande volume di soluzione può essere intrappolato nella colonna (inchiodato) e così concentrato. Sono necessari soltanto piccoli volumi di solvente sia per il lavaggio sia per l'eluizione (risparmio di solventi tossici e di materiale). Il costo delle colonne può essere ammortizzato risparmiando nell'acquisto e nello smaltimento del solvente. Possibilità di automazione dell intero processo 24

25 ESEMPI APPLICAZIONI SPE 25

26 Fenoli analizzabili FENOLI 26

27 SOLFANILUREE ERBICIDI AZOTATI 27