LA SPETTROMETRIA DI MASSA

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1 LA SPETTROMETRIA DI MASSA Tecnica che consente di caratterizzare e identificare composti sconosciuti e noti in base alla determinazione della loro massa molecolare e alla loro caratterizzazione strutturale (per es. sequenza amminoacidica nel caso di proteine) Uno spettrometro di massa (MS) genera, separa e rivela solo specie cariche (ioni), e misura i loro rapporti massa/carica (m/z) In MS si lavora in alto vuoto

2 Schema di uno spettrometro di massa Torr (Alto vuoto) 760 Torr Sorgente di ionizzazione Analizzatore Detector Sistema di raccolta dati Campione I composti sono ionizzati e volatilizzati Separazione degli ioni in base ai loro m/z Rivelazione degli ioni che arrivano dall analizzatore Produzione di uno spettro di massa

3 IONIZZAZIONE: COMPORTA LA VOLATILIZZAZIONE DEL COMPOSTO E QUINDI IL SUO PASSAGGIO IN FASE GASSOSA Molecola Ione molecolare

4 TIPI DI IONIZZAZIONE IONIZZAZIOEN A PRESSIONE ATMOSFERICA (API) ELECTROSPRAY (ES) IONIZAZIONE CIMICA A PRESSIONE ATMOSFERICA (APCI) IMPATTO ELETRONICO (EI) IONIZZAZIONE CIMICA (CI) FAST ATOM BOMBARDMENT (FAB) MATRIX ASSISTETD LASER DESORPTION (MALDI)

5 IONIZZAZIONE ESI Le molecole in fase liquida all estremità di un capillare in cui è presente un ago sotto potenziale elettrico ESI ElectroSpray Ionisation Dal capillare fuoriescono goccioline di solvente contenenti le molecole cariche: negative positive Dipende solvente dal Il solvente è evaporato fino ad ottenere degli ioni molecolari Mono-carica e Multi-carica vengono spinti dentro l analizzatore dal campo elettrico e convogliati grazie ad un sistema di lenti

6 Il potenziale applicato alla fine dell ago è sufficientemente alto da nebulizzare la soluzione in una miriade di goccioline cariche, contenenti il campione. + -

7 Formazione di ioni multicarica nella sorgente ESI Per vaporizzazione del solvente aumenta il campo elettrico della goccia e la densità di carica. IONI MULTI-CARICA: si muovono verso l analizzatore Le gocce di aerosol hanno ioni di carica opposta, di cui una dominante: in ambiente acido dominano gli ioni POSITIVI ESPLOSIONE COLOUMBIANA

8 Proteina con massa = Da In ambiente acido (p < 3) si protona, se possiede 12 gruppi che si caricano positivamente, genera 12 ioni multicarica diversamente protonati. La sorgente ionica ESI libera gli ioni multicarica dalle goccioline di solvente >>> passaggio alla fase gassosa

9 Proteina con massa = Da Gli ioni multicarica di una stessa proteina avranno un diverso rapporto m/z (MASSA/CARICA) (Da/cariche el. unitarie (Thomson) + 12 m/z = ( )/10 = 1001 [M+ + ] +10 m/z = ( )/9 = [M+ + ] +9 m/z = ( )/8 = [M+ + ] +8 m/z = ( )/7 = [M+ + ] +7 m/z = ( )/12 = [M+ + ] m/z = ( )/6 = [M+ + ] +6 m/z = ( )/5 = 2001 [M+ + ] +5 m/z = ( )/4 = 2501 [M+ + ] +4 m/z = ( )/3 = [M+ + ] m/z = ( )/11 = [M+ + ] +11 m/z = ( )/2 = 5001 [M+ + ] +2 m/z = ( )/1 = [M+ + ] +1

10 Sorgente Analizzatore Deve generare ioni in fase gassosa. Gli ioni vengono indirizzati all analizzatore che li deve separare Analizzatore Separa ioni con diverso valore di m/z Analizzatore magnetico Analizzatore a quadrupolo Analizzatore a trappola ionica (iontrap) Analizzatore TOF (time of flight tempo di volo)

11 ANALIZZATORE A TRAPPOLA IONICA La trappola ionica è un analizzatore dotato di un ELETTRODO ANULARE (a cui è applicato il voltaggio continuo) e due ELETTRODI INFERIORE E SUPERIORE, a cui è applicato voltaggio alternato, che hanno forma di due superfici convesse. Due piccoli buchi sugli elettrodi inferiore e superiore permettono la introduzione e l'uscita degli ioni. Gli ioni multicarica sono intrappolati all interno temporaneamente. Voltaggio a radiofrequenza principale applicato all elettrodo ad anello Elettrodi a cappuccio Elettrodo ad anello ESI Ingresso degli ioni Radiofrequenza supplementare Detector Gli ioni si muovono con delle oscillazioni stabili, diverse a seconda del loro rapporto m/z. Il voltaggio ad alta frequenza viene gradualmente aumentato e contemporaneamente le oscillazioni degli ioni sono destabilizzate: via via fuoriescono dalla trappola gli ioni con m/z crescente.

12 Film sulla trappola ionica =3uUwa1DDoQ

13 La sorgente ESI genera ioni multicarica che la TRAPPOLA IONICA separa in base al rapporto m/z

14 + 80 Da = incremento di massa dovuto alla presenza di un gruppo fosfato

15 Studio di miscele proteiche complesse: Separazione cromatografica (PLC) accoppiata alla rivelazione con spettrometro di massa INFORMAZIONI SPECIFICE CE SI POSSONO OTTENERE PER OGNI ANALITA (PROTEINA): Tempi di eluizione Massa Struttura ELEVATA SENSIBILITA Superiore a quella di un rivelatore UV, Capacità di rivelare quantità nell ordine dei femtogrammi (dipende dal tipo di MS)

16 La separazione cromatografica è effettuata in una colonna cromatografica, generalmente a fase inversa (RP). Le fasi mobili per una cromatografia in gradiente sono costituite da: Fase A, soluzione acquosa di acido formico (FA), acetico (AA) o trifluoroacetico (TFA) (p ) per rivelare ioni positivi o tamponi basici (p 8) per rivelare ioni negativi. Fase B, miscela idro-organica di acqua e acetonitrile o metanolo e FA o TFA o AA Cromatografo liquido (PLC) Colonna cromatografica Sorgente electrospray (ESI) Spettrometro di massa (Trappola ionica) L eluato in uscita dalla colonna è inviato alla sorgente ESI, oppure ripartito fra un rivelatore UV e l MS, dove avviene il processo di ionizzazione. Gli ioni vengono trasferiti nell analizzatore (trappola ionica ) per essere separati in base al rapporto m/z e poi rivelati dal detector.

17 COLONNA CROMATOGRAFICA A FASE INVERSA (RP- PLC): Fase stazionaria: particelle di silice funzionalizzate con catene carboniose idrofobiche con n atomi di carbonio (C4, C8, C18) Più sono lunghe le catene idrocarburiche maggiore è capacità della fase stazionaria di trattenere proteine Eluizione in gradiente fra una fase mobile (A) ACQUOSA/ACIDA e una fase mobile (B) IDRO- ORGANICA (ACQUA/ACETONITRILE) Si parte dal 100% di fase A (0%B) e si arriva al 100% di fase B (0%A). Peptidi e proteine in ambiente acido sono prevalentemente PROTONATI, quelli con pi più basici risultano più polari di quelli con pi più acidi. Peptidi/proteine più POLARI ELUISCONO PER PRIMI con la fase A, Peptidi/proteine più IDROFOBICI ELUISCONO PER ULTIMI, sono eluiti dalla fase B organica