CHIMICA ANALITICA. Gas Chromatography

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1 CHIMICA ANALITICA GC Gas Chromatography Dott. Carlo Carlo I.G. Tuberoso I.G. Tuberoso Appunti Appunti didattici didattici uso laboratorio Chimica Analitica ver. 00 ver

2 La gas cromatografia si basa sull analisi di un campione che viene vaporizzato, trascinato all interno della colonna cromatografica da un flusso di gas (carrier( carrier), separato nei suoi costituenti che vengono determinati da un opportuno rivelatore. GAS-CROMATOGRAFO

3 Il gas di trasporto (carrier( carrier) ) costituisce la fase mobile, mentre la fase stazionaria può essere composta da un liquido o un solido. I movimenti cinetici delle molecole fanno si che vi sia un continuo scambio di molecole di soluto fra le due fasi. Se un particolare soluto si distribuisce prevalentemente nella fase gassosa, le molecole passeranno la maggior parte del loro tempo nel carrier e saranno trasportate lontano dagli altri soluti che invece sono maggiormente trattenuti dalla fase stazionaria.

4 Per una data specie, il rapporto fra il tempo speso nella fase mobile e quello speso nella fase stazionaria, è uguale al rapporto delle concentrazioni in queste fasi, conosciuto come coefficiente di ripartizione. Le forze che permettono la migrazione del soluto sono dovute al movimento del gas di trasporto, mentre le forze che tendono a trattenere il soluto sono date dall affinit affinità per la fase stazionaria. La combinazione di queste forze produce la separazione.

5 CONFRONTO GC-HPLC In GC sono eluibili,, direttamente senza alcuna modificazione del campione, solo circa il 20% dei composti organici noti. Le limitazioni maggiori sono dovute al fatto che i soluti devono essere volatili e termostabili.. Non possono essere analizzati direttamente composti ionici e macromolecole. La sola fase stazionaria è disponibile per l interazione l con il campione.

6 La cromatografia liquida non presenta limitazioni di questo tipo. Per questo essa è adatta sia per analizzare composti con bassa tensione di vapore (macromolecole, proteine, polisaccaridi, composti ionici), che per analizzare prodotti termolabili (aminoacidi, coloranti, acidi nucleici ecc.). Sia la fase stazionaria che la fase mobile interagiscono con il campione

7 I componenti basilari di un gascromatografo sono: il gas di trasporto (carrier), l iniettorel iniettore,, la camera termostatata (forno o oven), la colonna,, il rivelatore (detector)) ed il registratore.

8 LA FASE MOBILE Il gas di trasporto deve essere chimicamente inerte. I gas più comunemente usati sono l Elio, l l Argon, l l Azoto e l Idrogeno l e la scelta del carrier spesso può dipendere dal tipo di detector che si deve usare.

9 L INIETTORE Il più comune metodo di introduzione del campione è quello che prevede l utilizzo l di una microsiringa che, dopo aver forato un setto di gomma, introduce il campione in una camera di vaporizzazione (calda) posta in testa alla colonna.

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11 Il perché dello standard interno... Ritornando alla presentazione di Statistica,, quando si è parlato della retta di taratura con il metodo dello standard interno, si è fatto riferimento alla gas- cromatografia. Infatti, è proprio durante la fase di iniezione che si può perdere un aliquota del campione e commettere un errore nella determinazione quantitative di un analita. Dimostrare perché la metodica dello standard interno elimina la possibilità di commettere tale errore.

12 La temperatura dell iniettore è in genere 50 C C più alta rispetto alla temperatura di ebollizione del componente meno volatile presente nella miscela da analizzare. Per ottenere la migliore efficienza della colonna, bisogna iniettare piccole quantità di campione. Grandi quantità di campione, iniettate lentamente, producono scodamenti dei picchi cromatografici e perdita di risoluzione. Nelle colonne attualmente utilizzate vengono iniettati massimo 2 μl.

13 Altri sistemi di introduzione S-HS (spazio di testa statico) SPME (microestrazione in fase solida) P&T (purge and trap, spazio di testa dinamico)

14 LA COLONNA

15 I moderni gascromatografi utilizzano colonne capillari. Sono formate da lunghi tubicini (capillari) di silice fusa con diametro interno di pochi decimi di millimetro. Nelle colonne capillari, la fase stazionaria è generalmente supportata dalle pareti interne del tubicino capillare; lo spessore del film liquido è generalmente compreso tra 0,1 μm m e 1,0 μm. La fase stazionaria liquida deve avere particolari caratteristiche: bassa volatilità,, stabilità termica, inerzia chimica e capacità di interagire con i soluti per dare una buona separazione.

16 Diversi tipi di colonne capillari

17 LE FASI STAZIONARIE

18 Lunghezza della colonna: m 100m Diametro interno della colonna: 0,2-0,32mm 0,32mm Spessore del film: 0,1-0,25 0,25 m

19 IL FORNO ( (oven) Per poter ottenere risultati precisi e ripetibili, la temperatura del forno deve poter essere controllata con la precisione del decimo di grado. Per una determinata analisi la temperatura ottimale della colonna dipende dal punto di ebollizione del campione.

20 Se abbiamo una miscela di composti aventi punti di ebollizione molto differenti tra loro, allora dobbiamo usare una programmata termica.. La temperatura della colonna verrà aumentata continuamente o per steps man mano che la separazione procede.

21 DETECTOR ( (rivelatore) I detector gascromatografici,, rilevano i vapori di soluto appena essi emergono dalla colonna e interagiscono con esso. Il detector converte questa interazione in segnale elettrico che viene inviato ad un elaboratore (registratore, computer). L area L o l altezza l di questo segnale viene riportata su un grafico contro il tempo d analisi (a partire dal momento in cui il campione è stato iniettato) e viene generato un cromatogramma.

22 Le caratteristiche principali per valutare la risposta di un detector sono: sensibilità, selettività e range dinamico.. Nella pratica sono utili anche la stabilità e la ripetibilità. Alcuni detector sono sensibili a qualunque tipo di soluto che eluisce dalla colonna (detector non selettivi), mentre altri rispondono solo a soluti con strutture specifiche, particolari gruppi funzionali o particolari atomi (detector selettivi).

23 I DETECTOR a conducibilità termica (TCD) a ionizzazione di fiamma (FID) a cattura di elettroni (ECD) a conducibilità elettrolitica (ELCD) amperometrico per lo zolfo (ASD) termoionico (TID o NPD) fotometrico a fiamma (FPD) a fotoionizzazione (PID) ad emissione atomica (AED) a chemiluminescenza spettrometria di massa (MS)

24 I DETECTOR

25 Detector ad ionizzazione di fiamma (FID) È il detector più comune per la GC. Si tratta di un detector universale capace di misurare la presenza di quasi tutte le sostanze organiche e qualche composto inorganico e per questo poco selettivo. Si basa sul fatto che molti composti organici, quando bruciano in i una fiamma, producono intermedi ionici che possono aumentare la conducibilità della fiamma stessa. Gli ioni generati sono raccolti in un elettrodo e creano la corrente.

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27 Vantaggi: - detector universale per composti organici - i composti inorganici non sono rivelati - gas carrier non è rivelato - limite di rivelabilità: : g - buon range lineare e dinamico Svantaggi: - detector distruttivo

28 Detector Azoto-Fosforo (NPD) I vapori di alogenuro alcalino formano con i composti dell azoto e del fosforo specie ioniche molto stabili che sono in grado di raggiungere l anodo l posto sopra la pastiglia di alogenuro.

29 La selettività nei confronti dei composti da rilevare può essere ottenuta utilizzando alogenuri alcalini differenti o settando il detector nelle condizioni operative richieste. CsBr P RbCl N

30 Detector a cattura di elettroni (ECD)

31 Trasformazione ed acquisizione dati

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33 La GC-MS è una tecnica analitica molto potente in quanto permette di separare i diversi componenti di una miscela (CG) e avere informazioni sulla loro natura (MS).

34 I dati ottenuti (cromatogramma) corrispondono a un diagramma tridimensionale dove, in funzione del tempo di ritenzione, i composti vengono separati grazie ai loro m/z e quantificati in base all abbondanza. abbondanza. Lo spettrometro di massa non misura direttamente la massa ma il rapporto massa/carica (m/z) degli ioni che si formano dalla molecola in esame. La maggior parte degli ioni che si possono riscontrare in spettrometria di massa possiede solo una carica così che il loro valore di m/z coincide con la massa molecolare espressa in Dalton.

35 Schema di uno spettrometro di massa generazione di ioni in fase gassosa separazione degli ioni in funzione del rapporto m/z rivelazione degli ioni cosi separati spettro di massa

36 Funzionamento di un GC-MS

37 Schematicamente un GC-MS può essere suddiviso in una parte costituita dal gas-cromatografo e nel rivelatore di massa. Le due parti sono unite da un interfaccia e il tutto lavora sotto vuoto grazie ad un sistema di pompe. Il vuoto è fondamentale per la produzione di elettroni e ioni liberi.

38 Interfaccia GC-MS (tipo diretto) Pompe rotative: 10-2 /10-4 torr Sistemi per il vuoto Pompe turbomolecolari o a diffusione: 10-5 torr

39 Schema di un rivelatore MS a quadrupolo

40 Il principio su cui si basa la MS è la frammentazione delle molecole a seguito di somministrazione di energia. I frammenti che si formano sono tipici della molecola di partenza. Nel caso dell impatto elettronico il processo può essere rappresentato nel seguente modo:

41 Generazione di ioni in fase gassosa EI--Electron impact Ionization hard CI--Chemical Ionization soft APCI--Atmospheric pressure Chemical Ionisation soft ESI--ElectroSpray Ionisation soft

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43 ACCOPPIAMENTI INTRODUZIONE-IONIZZAZIONE SOSTANZA INTRODUZIONE IONIZZAZIONE Volatile Poco polare Polare Molto polare GC GC GC (Deriv) LC EI EI\CI EI\CI ESI\APCI

44 A seconda della modalità di frammentazione si ottengono spettri di massa differenti che forniscono informazioni particolari.

45 Sistema di ionizzazione (EI)

46 EI - Electron impact Ionisation E la modalità più classica, tuttora molto utilizzata. E una ionizzazione hard. Il campione deve essere in stato di vapore. Adatto per composti piccoli (< 800 Da), volatili, termicamente stabili. Interfaccia con GC M + e - M e - catione radicale detto ione molecolare

47 CI: Chemical ionization Produce ioni per trasferimento di un protone Le molecole sono esposte ad un eccesso di gas reagente ionizzato (esp. CH 5 +) Questo produce uno ione positivo [M+H] + M + H + [M+H] + ADDOTTO

48 EI CI

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50 Analizzatore L analizzatore è la parte del rivelatore di massa dove avviene la separazione dei frammenti in funzione del m/z. L analizzatore a quadrupolo è costituito da quattro cilindri accoppiati due a due (x e y) e mantenuti ad un appropriato voltaggio. Solo un frammento di m/z opportuno può attraversare il quadrupolo (z) e arrivare al rivelatore.

51 _ + + _

52 Gli elettrodi sono disposti a sandwich,, due coperchi ed uno anulare. Trattiene tutti gli ioni non selezionati per successivi esperimenti. Gli ioni vengono rilasciati progressivamente verso il rivelatore variando il campo elettrico.

53 Una volta che i frammenti sono stati separati dall analizzatore, questi devono essere convertiti in un segnale. Ciò avviene in un rivelatore elettromoltiplicatore, costituito da una superficie che quando viene urtata da uno ione libera elettroni con effetto cascata.

54 TIC (Total Ion Current) vs Gas-Cromatogramma Abundance TIC: AB015.D Time--> Abbondanza ionica

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56 Ione molecolare Picco base

57 Cos è lo spettro di massa? Molecola incognita Spettro di confronto spettro di massa : mappa dell abbondanza relativa degli ioni prodotti in funzione del rapporto massa/carica (m/z)

58 ALCOLI SUPERIORI Questa tecnica gas-cromatografica permette di dosare quantitativamente (impiegando come standard interno l 1-pentanolo) l i seguenti composti: acetaldeide, etilacetato,, metanolo, 2-2 butanolo, 1-propanolo, 1 2-metil 2 propanolo,, 1-butanolo, 1 alcoli isoamilici. Colonna capillare Supelcowax 10 o Carbowax (30m, 0,2 mm d.i.,., 20mm); Iniettore split 1:50, t=140 C; 1,0 l FID t= 200 C C, H2 70 KPa,, aria 100 KPa; Carrier: He 1 ml/min min; ; Make-up N2 80 KPa; programmata: 6 min a 40 C, 5 C/ 5 C/min,, 2 min a 75 C, 20 C/ C/min,, 5 min a 170 C, 30 C/ C/min,, 3 min a 200 C.

59 GLICOLI Questa tecnica gas-cromatografica permette di dosare quantitativamente il 2,3butandiolo, il 1,2propandiolo, l etilenglicolel e il glicerolo previa estrazione SPE su NH 2. Colonna capillare Carbowax (30m, 0,25 mm d.i.,., 0,25 m); Iniettore split 1:25, t=250 C; 1,0 l FID t= 250 C C, H 2 60 KPa,, aria 110 KPa; Carrier: He 1 ml/min min; ; Make-up: N 2 80 KPa; programmata di temperatura: da 40 a 80 C C a 10 C/minuto; da 80 C C a 200 C C a 3 C/minuto; 3 da 200 C C a 210 C C a 5 C/minuto 5 isoterma a 210 C C per 20 minuti

60 TERPENI LIBERI E GLICOSIDATI Questa tecnica gas-cromatografica permette di dosare quantitativamente il 2,3butandiolo, il 1,2propandiolo, l etilenglicolel e il glicerolo previa estrazione SPE su C 18. Colonna capillare FFAP ECONOCAP ALLTECH (30m, 0,25 mm d.i.,., 0,25 m); Iniettore split 1:30, t=250 C; 1,0 l FID t= 250 C C, H 2 60 KPa,, aria 110 KPa; Carrier: He 1 ml/min min; Make-up: N 2 80 KPa; programmata di temperatura: da 40 C C a 60 C C a 40 C/m; 2 m a 60 C; da 60 C C a 190 C C a 2 C/m; 2 da 190 C C a 230 C C a 5 C/m; 5 15 m a 230 C.

61 FRAZIONE VOLATILE Questa tecnica gas-cromatografica permette di dosare quantitativamente numerosi composti ossigenati (alcoli, aldeidi, chetoni, acidi, esteri) previa estrazione SPE su C 18. Colonna capillare FFAP ECONOCAP ALLTECH (30m, 0,25 mm d.i.,., 0,25 m); Iniettore split 1:30, t=250 C; 1,0 l FID t= 250 C C, H 2 60 KPa,, aria 110 KPa; Carrier: He 1 ml/min min; Make-up: N 2 80 KPa; programmata di temperatura: da 40 C C a 60 C C a 40 C/m; 2 m a 60 C; da 60 C C a 190 C C a 2 C/m; 2 da 190 C C a 230 C C a 5 C/m; 5 15 m a 230 C.

62 TCA & Co. Questa tecnica gas-cromatografica permette di dosare quantitativamente i composti responsabili dell odore di tappo.. (alcoli, aldeidi, chetoni, acidi, esteri) previa estrazione (liquido/liquido liquido,, SPE su C 18, SPME (fibra PDMS 100 µm) Composto ,4,6-tricloroanisolo (TCA) 2 2,4,6-triclorofenolo (TCP) 3 2,3,6 TCA 4 2,3,4 TCA 5 Pentacloroanisolo (PCA) 2 4 Colonna capillare DB-5MS J&W (30m, 0,25 mm d.i.,., 0,25 m); Iniettore split 1:10, t=250 C; 1,0 l Rivelatore ECD t= 300 C Carrier: : N kpa; ; Make-up N kpa Programmata : 60 C C per 2 min; da 60 C C a 200 C C a 8 C/m; 8 2 min a 200 C.