Cos è uno spettrometro di massa

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1 Cos è uno spettrometro di massa Lo spettrometro di massa è uno strumento che produce ioni e li separa in fase gassosa in base al loro rapporto massa/carica (m/z). Un analisi in spettrometria di massa può essere rappresentata dai seguenti passaggi: Introduzione del campione Ionizzazione Analisi della massa Rivelazione degli ioni/analisi dei dati.

2 Scopi della spettrometria di massa Identificazione di componenti di una miscela Indagini quantitative Determinazione del peso molecolare Delucidazione della struttura molecolare Studi meccanicistici Studio di interazioni intermolecolari

3 Proteomica Glicobiologia Genetica e medicina Biologia molecolare e cellulare Scienze ambientali Chimica dei polimeri Antiterrorismo Farmacologia Antidoping Archeologia Astronomia Analisi inorganica e ancora tante altre Aree di interesse

4 Alcune applicazioni - MS classica Misure di massa accurate possono essere usate per trovare la formula empirica che si appaia ad esse. Fingerprints di frammentazione (specifici per ciascun composto) possono essere usati per identificare campioni comparandoli a fingerprints presenti nei database. Frammentazioni controllate (ottenute con MS/MS e MS n ) possono essere usate per l elucidazione strutturale di composti ignoti. Picchi standard osservati in uno spettro possono dare informazioni utili relativamente a gruppi funzionali. Miscele complesse possono essere analizzate per mezzo di tecniche composte ('hyphenated ) quali GC-MS e HPLC-MS, evitando così il lungo tempo necessario per purificare il campione.

5 Alcune applicazioni - MS piu recente Peptidi Determinazione della massa molecolare identificazione. Analisi di sequenza. Analisi di miscele complesse, come quelle derivanti da digestioni proteasiche di proteine (LC/MS o CE/MS). Proteine Determinazione della massa molecolare - identificazione. Modificazioni post-traduzionali. Localizzazione di legami disolfuro. Interazioni noncovalenti.

6 Caratteristiche della spettrometria di massa Intervallo di PM fino a centinaia di kda Sensibilità dell ordine delle picomoli o inferiore Acquisizione veloce dei dati Interfacce con metodi separativi Alta e bassa risoluzione

7 Schema di uno spettrometro di massa generazione di ioni in fase gassosa separazione degli ioni in funzione del rapporto m/z rivelazione degli ioni cosi separati spettro di massa spettro di massa : mappa dell abbondanza relativa degli ioni prodotti in funzione del rapporto massa/carica (m/z)

8 Modalità di ionizzazione Hard Ionization: Ionizzazione elettronica Electron Ionization (EI) Soft Ionization: Ionizzazione chimica Chemical Ionization (CI) Bombardamento con atomi veloci Fast Atom Bombardment (FAB) Ionizzazione termospray Thermospray Ionization (TSP) Ionizzazione elettrospray Electrospray Ionization (ESI) Ionizzazione chimica a pressione atmosferica Atmospheric Pressure Chemical Ionization (APCI) Desorbimento laser assistito da matrice Matrix Assisted Laser Desorption (MALDI)

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13 Ionizzazione elettronica (EI) Vantaggi Spettri ben interpretabili La frammentazione fornisce informazioni di tipo strutturale Gli spettri sono riproducibili Svantaggi Per alcuni composti lo ione molecolare puo essere poco rappresentato o addirittua assente Applicabile solo a composti volatili, termostabili, neutri e con peso molecolare non elevato

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15 Ionizzazione chimica Generalmente in uno spettrometro di massa la pressione e' mantenuta la piu' bassa possibile con efficienti sistemi di pompaggio ( mmhg), e reazioni bimolecolari (es. ione-molecola) sono estremamente improbabili. La ionizzazione chimica avviene invece se introduciamo nella camera di ionizzazione un gas reagente, ad esempio metano, in concentrazioni relativamente elevate (1 mmhg). Lo ione molecolare del metano generato per impatto elettronico puo' reagire con l'eccesso di metano: Il catione CH 5+, è un acido forte, puo' quindi protonare con una reazione acido-base praticamente qualsiasi molecola organica. Questa tecnica di ionizzazione genera uno ione pseudomolecolare (M+H) + con un bassissimo eccesso di energia vibrazionale, e le reazioni di frammentazione sono quindi poco importanti.

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17 M + [M+H] +

18 Schema di uno spettrometro di massa generazione di ioni in fase gassosa separazione degli ioni in funzione del rapporto m/z rivelazione degli ioni cosi separati spettro di massa

19 separazione degli ioni in funzione del rapporto m/z: - Strumenti a settore - Analizzatori di massa a quadrupolo - Time-of-Flight (TOF)

20 Quadrupole Mass Analyzers +U +Vcos( t) U Vcos( t) Per un dato valore dei potenziali solo gli ioni con un singolo valore del rapporto m/z raggiungono il rivelatore. La scansione di uno spettro si ottiene facendo variare simultaneamente Vcc e Vac, mantenendo costante il loro rapporto.

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22 Spettrometro di massa a triplo quadrupolo

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24 Interpretazione dello spettro di massa Nella comune pratica di laboratorio, si suggerisce prima di tutto di eseguire un confronto computerizzato dello spettro appena registrato con il vasto archivio di spettri ormai disponibile su tutti gli spettrometri commerciali. Anche se la molecola esaminata non e' compresa nell'archivio, l'elaboratore elenca una serie di composti che contengono il maggior numero possibile di ioni comuni con lo spettro incognito. L'identificazione di ioni caratteristici e' uno stadio importante anche nell'interpretazione "manuale" degli spettri di massa: l'aiuto di un computer quindi non guasta. Nell'interpretazione non assistita, normalmente si segue una procedura abbastanza semplice: 1.Identificazione dello ione molecolare. 2.Identificazione di ioni caratteristici. 3.Identificazione di processi di frammentazione caratteristici.

25 Ione molecolare E' lo ione (positivo) generato per ionizzazione della molecola da analizzare. Dopo ionizzazione per impatto elettronico e' una specie a numero dispari di elettroni: M + e- ----> M*+ + 2e- Non necessariamente e' osservabile nello spettro. Ad esempio negli alcoli alifatici a lunga catena e' di regola assente. Spesso e' possibile osservare ioni molecolari piu' intensi riducendo l'energia del fascio elettronico di ionizzazione. Metodi alternativi di ionizzazione producono ioni molecolari piu' intensi e relativamente meno ioni frammento. Lavorando ad alta risoluzione, la massa esatta dello ione molecolare fornisce direttamente la composizione elementare del composto incognito. - E' lo ione a massa più alta dello spettro. - E' legato ad altri ioni attraverso perdite logiche Esistono delle regole generali: - Se la molecola contiene solamente C, H, O, S, Alogeni o un numero pari di atomi di azoto, lo ione molecolare e' di massa nominale pari. - Se la molecola contiene un numero dispari di atomi di azoto, la massa nominale dello ione molecolare e' dispari.

26 Spettro di massa Picco Base CH 3 O C CH 2 CH 3-29 Ione Molecolare m/z 43 m/z 57-15

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34 Esempio di spettro di massa (EI): acido benzoico 1. Identificazione dello ione molecolare. 2. Identificazione di ioni caratteristici. 3. Identificazione di processi di frammentazione caratteristici. 4. Ricostruzione della struttura della molecola sulla base della conoscenza di meccanismi di frammentazione standard.

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