IMPORTANZA DELLA SPETTROMETRIA DI MASSA NEL CAMPO BIOTECNOLOGICO

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1 UNIVERSITA DEGLI STUDI DI URBINO Carlo Bo FACOLTA DI SCIENZE e TECNOLOGIE Corso di laurea in Biotecnologie IMPORTANZA DELLA SPETTROMETRIA DI MASSA NEL CAMPO BIOTECNOLOGICO Docente: Anna Rita Mastrogiacomo Anno Accademico 2009/10

2 Spettrometria di massa E una tecnica analitica potente usata per : Identificare prodotti incogniti. Determinazioni quantitative di composti noti. Chiarire le proprietà chimiche e strutturali delle molecole. Utilizza quantità di campione estremamente limitate (in alcuni casi meno di un picogrammo grammi) a concentrazioni molto basse in miscele complesse( fino a una parte per mille miliardi)

3 A cosa serve Fornire informazioni attendibili per una grande varietà di persone che operano in campi diversi: Medici Magistrati Ingegneri addetti al controllo di processo Chimici Astronomi Biologi Ecc.

4 Scopi della spettrometria di massa Determinazione del peso molecolare Delucidazione della struttura molecolare Identificazione di componenti di una miscela Indagini quantitative Studi meccanicistici Studio di interazioni intermolecolari

5 Aree di interesse Proteomica Genetica e medicina Biologia molecolare e cellulare Scienze ambientali Chimica dei polimeri Antiterrorismo Farmacologia Antidoping Archeologia Astronomia Analisi inorganica e e ancora tante altre

6 Caratteristiche della spettrometria di massa Intervallo di PM fino a centinaia di kda Sensibilità dell ordine delle picomoli o inferiore Acquisizione veloce dei dati Interfacce con metodi separativi Alta e bassa risoluzione

7 Spettrometria di massa Le molecole sono molto piccole! Ci vogliono approsimativamente ( )molecole di acqua per fare un grammo! Per pesare le molecole conviene usare il dalton (Da). 1 Da corrisponde alla dodicesima parte dell'atomo di carbonio ( 12 C). In questa scala l'ossigeno ( 16 O) pesa 15,9949 e l'idrogeno ( 1 H) pesa 1, L'acqua pesa quindi circa 18 (18, ).

8 La spettrometria di massa converte le sostanze in ioni prima di poterle pesare

9 Cos è uno spettrometro di massa Lo spettrometro di massa è uno strumento che produce ioni e li separa in fase gassosa in base al loro rapporto massa/carica (m/z). Un analisi mass spettrometrica può essere rappresentata dai seguenti passaggi: Introduzione del campione Ionizzazione Analisi della massa Rivelazione degli ioni/analisi dei dati.

10 Massa atomica e massa nominale Massa atomica: viene cacolata eseguendo la media pesata delle masse degli isotopi di un determinato elemento. Il bromo è formato per il 50,69% di 79 Br avente massa di 78,91934 Da e il 49,31% 81 Br con massa di 80,91629 Da. La massa atomica è (0,5069)(78,91934)+(0,4931)(80,91629)=79,904 Da. Massa molecolare: di una molecola o di uno ione di una molecola o di uno ione è data dalla somma delle masse atomiche degli elementi che la compongono, calcolata dalle masse riportate nella tavola periodica.nel caso del bromoetano C 2 H 5 Br la massa molecolare è (2x12,0107)+(5x1,00794)+(1x79,904)=108,965. Massa nominale : di una molecola o di uno ione di una molecola o di uno ione è il valore intera della massa calcolato considerando l isotopo l più abbondante di ognuno degli atomi costituenti. Per il carbonio, l idrogeno l e il bromo gli isotopi più abbondanti sono 12 C, 1 H e 79 Br. Quindi la massa nominale di C 2 H 5 Br è (2x12)+(5x1)+(1x79)=108

11 Massa Nominale: e' coincidente con il numero di protoni e neutroni che contiene l'isotopo. Lo spettrometro di massa misura il rapporto massa/carica degli ioni: e' quindi in grado di distinguere i singoli isotopi di ciascun elemento. Massa Esatta: e' la massa "relativistica" dell'isotopo; non coincide quindi con n la somma delle masse esatte dei protoni e neutroni contenuti, ma e' determinata anche dall'energia di legame (nucleare). L'unita' di misura e' ottenuta ponendo uguale a 12 esatto la massa dell'isotopo opo 12C. 12 C. Peso Atomico: (quello usato in stechiometria): e' la media ponderale delle masse se esatte degli isotopi presenti in natura di quel particolare elemento. ento.

12 Relative Isotope Abundance of Common Elements Element Isotope Relative Abundance Isotope Relative Abundance Carbon 12 C C 1.11 Hydrogen 1 H H.016 Nitrogen 14 N N.38 Oxygen 16 O O O.20 Sulfur 32 S S S 4.40 Chlorine 35 Cl Cl 32.5 Bromine 79 Br Br 98.0 Isotope Relative Abundance

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14 Spettro di massa Massa nominale: 2-butanone = 72 (CH 3 =15; CH 2 CH 3 =29)

15 Alcune applicazioni - MS classica Accurate mass measurements can be used to match empirical formulae. Fragmentation fingerprints (specific to each compound) can be used to identify samples by comparison to fragment databases. Controlled fragmentation (through MS/MS and MS n ) can be used for structural elucidation of novel compounds. Common peaks observed in a spectrum can give useful information regarding functional groups. Complex mixtures can be analysed via 'hyphenated' techniques such as GC-MS and HPLC-MS, thus negating the need for time consuming sample purification.

16 Peptides Alcune applicazioni - MS piu recente Determination of molecular mass - identification Sequence analysis Analysis of complex mixtures, like protease digests of proteins (LC/MS or CE/MS) Proteins Determination of molecular mass - identification Post-translational translational modifications Location of disulfide linkages Non-covalent interactions

17 Schema di uno spettrometro di massa generazione di ioni in fase gassosa separazione degli ioni in funzione del rapporto m/z rivelazione degli ioni cosi separati spettro di massa spettro di massa : mappa dell abbondanza relativa degli ioni prodotti in funzione del rapporto massa/carica (m/z). Se tutte le cariche sono+1, m/z è numericamente uguale alla massa. Se, invece, uno ione ha carica +2, m/z è pari a ½ della massa.

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19 Schema di uno spettrometro di massa generazione di ioni in fase gassosa separazione degli ioni in funzione del rapporto m/z rivelazione degli ioni cosi separati spettro di massa

20 Hard Ionization: Modalità di ionizzazione Ionizzazione elettronica Electron Ionization (EI) Soft Ionization: Ionizzazione chimica Chemical Ionization (CI) Bombardamento con atomi veloci Fast Atom Bombardment (FAB) Ionizzazione termospray Thermospray Ionization (TSP) Ionizzazione elettrospray Electrospray Ionization (ESI) Ionizzazione chimica a pressione atmosferica Atmospheric Pressure Chemical Ionization (APCI) Desorbimento laser assistito da matrice Matrix Assisted Laser Desorption (MALDI)

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23 Ionizzazione elettronica (EI) Nella camera di ionizzazione le molecole del campione da analizzare, are, in fase gassosa, interagiscono con un fascio di elettroni generato da un filamento incandescente (Renio o Tugsteno) ed accelerato attraverso un potenziale regolabile dall'operatore. L'energia del fascio e' normalmente fissata a 70 ev. La relazione tra il momento di un elettrone - considerato come particella - e la sua lunghezza d'onda e' fornita dall'equazione di De Broglie: λ=h/mv Agli elettroni di 70 ev impiegati per la ionizzazione puo' quindi i essere associata una lunghezza d'onda di ca. 1.4 Å. Durante l'avvicinamento degli elettroni alla molecola bersaglio, l'onda elettronica ed il campo elettrico molecolare interagiscono tra di loro con una mutua distorsione. L'onda elettronica distorta puo' esere considerata composta da un insieme di radiazioni di differente lunghezza l d'onda, alcune delle quali hanno la frequenza corretta per interagire con gli elettroni della molecola. In termini quanto-meccanici l'impatto elettronico puo' quindi promuovere eccitazioni ni elettroniche simili a quelle osservate nella spettroscopia UV, fino ad ottenere anche l'espulsione di un elettrone dalla molecola con formazione di uno ione radicale positivo, lo Ione Molecolare M(.+): e - + M ---> > M.+ + 2e -

24 EI - Electron impact Ionisation E la modalita piu classica, tuttora molto utilizzata. E una ionizzazione hard. Il campione deve essere in stato di vapore. Adatto per composti piccoli (< 800 Da), volatili, termicamente stabili. Interfaccia con GC, anche HPLC.

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26 Spettro di massa Picco Base CH 3 O C CH 2 CH 3-29 Ione Molecolare m/z 43 m/z 57-15

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31 Ionizzazione elettronica (EI) Vantaggi Spettri ben interpretabili La frammentazione fornisce informazioni di tipo strutturale Gli spettri sono riproducibili Svantaggi Per alcuni composti lo ione molecolare puo essere poco rappresentato o addirittua assente Applicabile solo a composti volatili, termostabili, neutri e con peso molecolare non elevato

32 EI mass spectrum

33 Ionizzazione chimica Generalmente in uno spettrometro di massa la pressione e' mantenuta la piu' bassa possibile con efficienti sistemi di pompaggio ( mmhg), e reazioni bimolecolari (es. ione-molecola) sono estremamente improbabili. La ionizzazione chimica avviene invece se introduciamo nella camera di ionizzazione un gas reagente, ad esempio metano, in concentrazioni relativamente elevate (1 mmhg). Lo ione molecolare del metano generato per impatto elettronico puo' p reagire con l'eccesso di metano: Il catione CH + 5, è un acido forte, puo' quindi protonare con una reazione acido-base praticamente qualsiasi molecola organica. Questa tecnica di ionizzazione genera uno ione pseudo-molecolare (M+H) + con un bassissimo eccesso di energia vibrazionale, e le reazioni di frammentazione sono quindi poco importanti.

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35 M + [M+H] +

36 Ionizzazione elettrospray Tecnica di ionizzazione in fase liquida a pressione atmosferica Ionizzazione delicata Molecole di polarità medio-alta Composti con basso ed alto PM fino a Spesso si formano ioni con carica multipla Comune la presenza di ioni addotto La fase mobile deve essere polare

37 ESI ElectroSpray Ionisation Il potenziale applicato alla fine dell ago e e sufficientemente alto da nebulizzare la soluzione in una miriade di goccioline cariche, contenenti il campione.

38 Quando il solvente evapora, la concentrazione di carica alla superficie della gocciolina aumenta fino a superare la tensione superficiale esplosione coulombica. Si formano ioni dell analita privi di solvente. Le e cariche sono statisticamente distribuite tra i siti disponibili dell analita, portando spesso alla formazione di ioni a cariche multiple. La tecnica ESI e e adatta per composti simili a quelli sottoponibili a MALDI, con sensibilita ed estensione di dimensioni molecolari un po minori. Ioni a carica multipla rapporto m/z basso rilevabile con spettrometri a settore o a quadrupolo. ESI si adatta all interfacciamento con HPLC e CE (Capillary Electrophoresis)

39 Ionizzazione elettrospray

40 Spettro electrospray

41 ESI-MS Spectrum of Metamidophos [M+Na] [M+K] [M+H] Ione Pseudomolecolare % m/z Nessuna Frammentazione Formazione di Addotti con ioni Na e K

42 ESI-MS Spectrum of Ubiquitin (MW 8564 Da) Nessuna Frammentazione Formazione di Ioni Multicarica

43 Spettro Deconvoluto dell Ubiquitina Ubiquitina Ossidata Ubiquitina Intatta Ubiquitina Carbossilata

44 Prestazioni Generali della Sorgente ESI Vantaggi Funziona bene con analiti volatili e non volatili, ionici e/o polari Informazioni sul peso molecolare Scarsa frammentazione Elevata sensibilità Permette la determinazione di alti pesi molecolari Interfacciamento con Cromatografia Liquida Svantaggi Scarsa frammentazione Non compatibile con l utilizzo di tamponi non volatili e solventi organici apolari. Ionizzazione inibita da alte concentrazioni saline

45 Ionizzazione chimica a pressione atmosferica Composti a più basso peso molecolare PM <1000 Formazione di ioni con carica singola Più energetica Maggiore potenzialità di frammentazione La fase mobile può essere non polare Cromatografia in fase normale Sono favoriti i composti con bassa polarità

46 Atmospheric Pressure Chemical Ionization (APCI) La APCI sfrutta i vapori di solvente che accompagnano l analita l durante l eluizione l cromatografica dopo un rapido riscaldamento, per produrre su di essi la prima ionizzazione mediante un elettrodo a corona. Le molecole di solvente ionizzate si comportano poi da reagente per la ionizzazione chimica degli analiti, in modo analogo a quanto avviene per la ionizzazione chimica tradizionale in GC-MS.

47 Meccanismo di generazione degli ioni in APCI Nebulizzatore riscaldato Molecole del solvente Molecole del campione Trasferimento di carica N 2 N 2 Liquido Ago corona Aerosol Molecole del campione solvatate Solvente ionizzato Campione ionizzato

48 APCI: sommario delle caratteristiche La APCI è adatta a composti anche non particolarmente polari, che possono essere in forma ionica in soluzione, ma non sono tipicamente acidi o basi forti. Il ph non ha una grossa influenza sulla risposta. Il flusso utilizzabile in APCI va da 0.2 a 2 ml/min. Un tipico flusso operativo è 1 ml/min. In condizioni APCI il parametro da fissare è la corrente di scarica, generalmente limitata a 2-32 µa. Questo valore induce un voltaggio sull ago paragonabile a quello normalmente impiegato per la ionizzazione electrospray. La APCI non porta in nessun caso alla formazione di ioni multicarica.

49 Campo di applicazione Composti di bassa o media polarità, volatili o semivolatili. In certi casi la APCI offre una sensibilità maggiore dell ESI, specialmente quando vengono utilizzati tamponi. In generale, la APCI può essere considerata complementare rispetto all ESI.

50 Fast Atom Bombardment (FAB) e Secondary Ion Mass Spectrometry (SIMS) FAB e SIMS sono tecniche in cui il campione è bombardato da una corrente di atomi/molecole neutri oppure di ioni. E indispensabile che il campione sia sciolto in una matrice. Questa è una tecnica eccellente per l analisi l in tracce ed è usata nall analisi analisi dei peptidi, nucleotidi, carboidrati e piccole molecole polari.

51 FAB - Fast Atom Bombardment Il campione viene prima dissolto in una matrice liquida (es. glicerolo). La superficie liquida viene bombardata da un fascio di atomi ad alta energia cinetica (xenon o argon). Le molecole di campione vengono cosi spruzzate via dalla superficie, entrano nella fase gassosa, e vengono ionizzate, per protonazione o deprotonazione. L introduzione di questa tecnica nei primi anni 80 ha rivoluzionato la spettrometria di massa, aprendola alla biologia e alla medicina. Adatto ad es. per peptidi, piccole proteine, altri biopolimeri (fino( a 5000). Ionizzazione soft. Quantita minima circa 20 picomoli.

52 Matrix Assisted Laser Desorption Ionization MALDI Il desorbimento mediante laser permette di ottenere ioni in fase gassosa. Le pulsazioni provenienti da un laser a W/cm 2 sono focalizzate sulla superficie del campione solido. Le pulsazioni estraggono materiale dalla superficie e creano un microplasma di ioni e di molecole neutre che possono reagire tra di loro in fase vapore. Le pulsazioni laser sono in grado sia di vaporizzare sia di ionizzare il campione.

53 Matrix Assisted Laser Desorption Ionization MALDI Principi operativi I passaggio: : il composto è mescolato ad una matrice che assorbe intensamente la lunghezza d onda d del laser. La miscela è asciugata e qualunque solvente rimosso. Ne risulta una soluzione solida costituita da analita e cristalli di matrice.

54 Matrix Assisted Laser Desorption Ionization MALDI II passaggio: le pulsazioni estraggono la soluzione solida ed inducono il riscaldamento della soluzione e la sublimazione della matrice. Una certa energia è trasferita alle molecole di analita che si ionizzano. Il MALDI permette il desorbimento e la ionizzazione di analiti ad altissimo PM (> Da). E E usato nell analisi di proteine ad alto PM, polimeri e biopolimeri.

55 MALDI - Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation Matrice cristallina (anziche liquida). Fascio di fotoni (anziche di atomi). Adatto per composti simili a quelli analizzabili con FAB, ma a piu alta sensibilita ( volte meglio) e con molti meno limiti nelle dimensioni dell analita: pesi molecolari fino a 300 kd. Ioni prodotti sono spesso solo a singola carica e necessario il ToF.

56 MALDI PROCESS Irradiation Desolvation Desorption H + Matrix Sample Proton transfer Sample Molecules are ionized by proton transfer from the matrix

57 MALDI-TOF Spectrum of Cytocrome C, Ubiquitin and Myoglobin

58 Matrix Application a-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA) Peptides (<10 KDa), lipids, carbohydrates Sinapinic acid (SA) Peptides and large proteins (10-150KDa), glycoproteins, membrane proteins Gentisic acid Peptides, proteins, carbohydrates, glycoproteins, glycolipids, polymers, lipids, organic molecules Trans-3-indoleacrylic acid (IAA) Synthetic polymers 3-hydroxypicolinic acid (HPA) Oligonulceotides > 3.5KDa 2,4,6-trihydroxyacetophenone (THAP) Oligonucleotides < 3.5KDa Dithranol (DIT) Polymers

59 Prestazioni Generali della Sorgente MALDI Advantages: Analysis of compounds with a MW in excess of Da High Sensitivity (from 100 fmol to 2 pmol No multicharged Ions Tolerance towards the presence of salts, buffers, and or other additives Analysis of complex mixtures Disadvantages: Analysis of compounds with a MW below 600 Da is difficult The resolution of TOF mass analyzer is limited No analysis of non-covalent complexes On-line coupling with an LC or CE equipment is very difficult.

60 Confronti tra tecniche di ionizzazione MS 200,000 ESI 15,000 1,000 APCI PM FAB EI/CI 10 NON POLARE MOLTO POLARE

61 Schema di uno spettrometro di massa generazione di ioni in fase gassosa separazione degli ioni in funzione del rapporto m/z rivelazione degli ioni cosi separati spettro di massa Se tutte le cariche sono +1, m/z è numericamente uguale alla massa. Se, invece, uno ione, ha ad esempio, carica +2, m/z è pari ad ½ della massa.

62 Risoluzione e potere risolvente Maggiore è il potere risolvente (m/δm) di uno spettrometro di massa, maggiore è la sua capacità di separare due picchi aventi masse simili.

63 Risoluzione Con il termine risoluzione si indica l inverso del potere risolvente (Δm/m),ossia la differenza di massa minima tra due picchi adiacenti che ne permette la separazione. Il potere risolvente è un numero grande, mentre la risoluzione è un numero piccolo.

64 Risoluzione

65 Risoluzione MS

66 Separazione degli ioni in funzione del rapporto m/z - Sector instruments - Quadrupole Mass Analyzers - Time-of of-flight (TOF)

67 Analizzatore magnetico a doppia focalizzazione E FFZ FFZ FFZ FFZ B F E sorgente F B rivelatore

68 Double Focussing Sector Analysis Un tale apparato e capace di una risoluzione maggiore di , cioe di distinguere uno ione di massa da uno di massa (10 ppm).

69 Quadrupole Mass Analyzers +U +Vcos(ωt) U Vcos(ωt) Sono piu piccoli, piu leggeri e meno costosi dei sistemi a settore. Di solito pero hanno una risoluzione minore ( 2000) e possono rilevare m/z solo fino a 4000.

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72 Time-of of-flight (TOF) Alta sensibilita e un ambito di misura delle masse virtualmente illimitato.

73 Risoluzione (strumento a bassa risoluzione) Traces showing resolution for the same compound on three different types of mass spectrometer Time-of-Flight (strumento ad alta risoluzione)

74 Spettrometro di massa a triplo quadrupolo

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80 Acquisizione cromatografia/ms

81 SCAN e SIM SCAN m/z SIM

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83 LC/MS non-polar polar ionic Particle beam APCI Electrospray

84 Particle beam interface LC MS nebulization desolvation enrichment

85 Schema di uno spettrometro di massa generazione di ioni in fase gassosa separazione degli ioni in funzione del rapporto m/z rivelazione degli ioni cosi separati spettro di massa

86 Interpretazione dello spettro di massa Nella comune pratica di laboratorio, si suggerisce prima di tutto o di eseguire un confronto computerizzato dello spettro appena registrato con il vasto archivio di spettri ormai disponibile su tutti gli spettrometri commerciali. Anche se la molecola esaminata non e' compresa nell'archivio, l'elaboratore elenca una serie di composti che contengono il maggior gior numero possibile di ioni comuni con lo spettro incognito. L'identificazione di ioni caratteristici teristici e' uno stadio importante anche nell'interpretazione "manuale" degli spettri di massa: l'aiuto di un computer quindi non guasta. Nell'interpretazione non assistita, normalmente si segue una procedura abbastanza semplice: 1.Identificazione dello ione molecolare. 2.Identificazione di ioni caratteristici. 3.Identificazione di processi di frammentazione caratteristici.

87 Interpretazione degli spettri di massa di semplici molecole (EI) 1. Identificazione dello ione molecolare. 2. Identificazione di ioni caratteristici. 3. Identificazione di processi di frammentazione caratteristici. 4. Ricostruzione della struttura della molecola sulla base della conoscenza di meccanismi di frammentazione standard.

88 Ione molecolare EE' lo ione (positivo) generato per ionizzazione della molecola da analizzare. Dopo ionizzazione per impatto elettronico e' una specie a numero dispari di elettroni: + e-e ----> > M*+ + 2e- non necessariamente e' osservabile nello spettro. Ad esempio negli alcoli alifatici a lunga catena e' di regola assente. Spesso e e possibile osservare ioni molecolari piu' intensi riducendo l'energia del fascio elettronico di ionizzazione. Metodi alternativi di ionizzazione producono ioni molecolari piu' intensi e relativamente meno ioni frammento. Lavorando ad alta risoluzione, la massa esatta dello ione molecolare fornisce direttamente la composizione osizione elementare del composto incognito. Esistono delle regole generali: - E' lo ione a massa più alta dello spettro. - E' legato ad altri ioni attraverso perdite logiche - Se la molecola contiene solamente C, H, O, S, Alogeni o un numero o pari di atomi di azoto, lo ione molecolare e' di massa nominale pari. - Se la molecola contiene un numero dispari di atomi di azoto, la massa nominale dello ione molecolare e' dispari.

89 Determinazione della massa molecolare con MALDI-TOF Spettro MALDI- TOF del peptide Angiotensina II Spettro MALDI- TOF di un anticorpo monoclonale

90 Distribuzione isotopica calcolata per un peptide (Angiotensina II) e per una proteina (β- Microglobulina)

91 Determinazione della massa molecolare con ESI Spettro ESI della Neurotensina (sopra) e della proteasi LA di E.coli (sotto). Determinazione del peso molecolare corrisponente

92 Separazione e analisi di una proteina dopo proteolisi, tramite abbinamento di HPLC a fase inversa e spettrometria di massa ESI (LC-MS)

93 Sequenziamento di peptidi con MALDI-TOF

94 MALDI MS spectrum: (A) the [M+H]+ion region of the glycopeptide (Asn138-Lys163) from the proteolytic digest of recombinant human macrophage colony stimulating factor. (B) the molecular ion region after treatment of this peptide with N- glycosidase F.

95 Non-covalent interactions MALDI MS spectrum of bovine hemoglobin before and after treatment with glutaraldehyde.