SCHEMA DI UN GASCROMATOGRAFO. He, Ar, N 2, H 2
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- Tommasa Mazzoni
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1 GASCROMATOGRAFIA La fase mobile è un gas. Le sostanze da separare (liquidi, solidi, gas) devono essere portate ad una temperatura sufficiente a renderle gassose o comunque portarle allo stato di vapore. Un analita gassoso viene trasportato attraverso la colonna da una fase mobile gassosa, detta gas di trasporto. A differenza della LC, LA FASE MOBILE NON HA EFFETTO COMPETITIVO: IL GAS DI TRASPORTO SERVE SOLO PER TRASCINARE I COMPONENTI LUNGO LA COLONNA
2 SCHEMA DI UN GASCROMATOGRAFO He, Ar, N 2, H 2 2
3 INIETTORI PER GC
4 Iniettore splitt
5 Classificazione delle tecniche gascromatografiche I criterio (stato fisico fase stazionaria) GC Gas solido Gas liquido II criterio (caratteristiche geometriche colonna ) GC Colonne impaccate Colonne capillari
6 Colonne gascromatografiche Si suddividono in impaccate e capillari. Le impaccate contengono particelle solide che vengono impaccate: diatomee o diatomee silanizzate, per ridurre la polarità mediante arricchimento superficiale di gruppi metilici. Le capillari sono tubi molto più sottili e lunghi (diametro = mm; lunghezza = m) in cui la fase stazionaria è depositata sulle pareti interne. Queste ultime hanno un elevato numero di piatti teorici (anche ) grazie alla loro elevata lunghezza.
7 Colonne impaccate: la fase stazionaria è formata da un solido granulare poroso o da un liquido deposto su un supporto costituito da particelle inerti. La colonna è costituita da un tubo di acciaio o vetro di lunghezza da 1 a 6 metri con diametro interno di mm. riempimento ID mm
8 Colonne capillari: la fase stazionaria viene depositata sotto forma di film sottilissimo (0.1-5µm) sulla parete interna di un capillare con diametro mm e lungo da 15 a 100 m. Il carrier percorre il canale lasciato libero dalla fase stazionaria
9 Colonna capillare standard a fase legata 9
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11 Fase Mobile: Il gas Carrier Il gas carrier deve avere le seguenti caratteristiche: elevata inerzia chimica verso gli analiti e la fase stazionaria (gas nobili e azoto) elevato grado di purezza. In particolare devono essere assenti umidità (disattivazione fase stazionaria), ossigeno (ossidazione fase stazionaria) e idrocarburi (aumento linea base) Compatibilità con il rivelatore I gas di trasporto più usati sono: idrogeno elio e miscele elio/idrogeno azoto argon Diossido di carbonio
12 La fonte del gas di trasporto può essere rappresentato da bombole di acciaio dotate di riduttore di pressione (un secondo riduttore di pressione è presente nella GC) In alternativa si possono utilizzare dei generatori di gas (per azoto e idrogeno)
13 Fasi stazionarie per GC Fasi stazionarie solide (di uso limitato rispetto alle fasi liquide): Il meccanismo di separazione è per adsorbimento (la separazione dipende dalla forza di legame tra le molecole di analita e i siti attivi della fase stazionaria). Si utilizza tale tecnica per separare gas che non ripartiscono nella fase liquida (azoto, ossigeno, monossido di carbonio) e molecole organiche e in genere composti bassobollenti (metanolo, etanolo, acqua). I materiali più usati come fase stazionaria sono: Gel di silice Allumina Carbone attivo (mediamente polare) Zeoliti (silicati di alluminio e sodio)
14 Fasi stazionarie liquide: In tale tecnica le molecole di analita si sciolgono nella fase stazionaria liquida. Si ha quindi una ripartizione dell analita tra la fase fissa (liquido) e la fase gassosa. Nelle colonne impaccate e nelle SCOT, la fase liquida è ancorata su un supporto inerte che deve avere le seguenti caratteristiche: Inerzia chimica Resistenza meccanica e termica Buon grado di bagnabilità da parte del liquido di ripartizione Bassa resistenza al flusso di gas Disponibilità sotto forma di particelle sferiche I materiali più usati sono Terra di diatomee (scheletri di piante unicellulari): materiale molto poroso con un buon grado di assorbività (fino al 30% del suo peso). I numerosi gruppi idrossilici vengono rimossi per silanizzazione con dimetilclorosilano (DMCS) o esametildisilazano (HMDS) Teflon: poco adsorbenti Vetro: poco adsorbenti
15 Sistema di termostatazione della colonna La temperatura è cruciale nelle separazioni cromatografiche e pertanto la colonna è alloggiata in forni termostatati. L analisi GC può essere effettuata a T costante (isoterma) o variabile (gradiente di temperatura). Le rampe di temperatura possono essere lineari o asimmetriche con diverse fasi di plateau. Temperatura Tempo
16 Influenza della T sui t R : più la temperatura è elevata più il soluto tende a trasferirsi nella fase gassosa aumentando T diminuisce t R programma di T Corso di laurea in Scienze e Tecnologie Alimentari
17 Rivelatori Dovrebbero avere le seguenti proprietà: : risposta lineare, stabilità,, risposta uniforme per i diversi analiti (o comunque prevedibile e più o meno selettiva). Il rivelatore ideale non esiste. Rivelatore a conducibilità termica: si basa sul principio del ponte di Wheatstone. controllo della corrente del filamento cella di riferimento cella del campione registratore attenuatore a ponte 4 filamenti: 2 sono circondati da gas di trasporto che fluisce in una corrente di riferimento, l altra l coppia è circondata da gas di trasporto che proviene dalla colonna. Quando il ponte è in equilibrio tra i punti 1 e 2 non appare alcun segnale. Una variazione della conducibilità termica del gas (dovuta all eluizione di analiti con il gas) produce un segnale tra 1 e 2. 17
18 Rivelatori a ionizzazione di fiamma (FID): E ampiamente utilizzato e di tipo universale. catodo anodo L effluente della colonna viene direzionato in una fiamma aria/idrogeno. La maggior parte dei composti organici quando pirolizzati in tale fiamma producono ioni ed elettronii che generano una corrente elettrica (segnale) Vantaggi: buona sensibilità, range dinamico, robusto Svantaggi: metodo distruttivo; non sensibile a composti non idrocarburici come ad es. N 2, O 2, CO 2, NH 3
19 Rivelatori a conducibilità termica (TCD): Rivelatore storico e ancora adesso diffuso. E un esempio di rivelatore robusto e universale. Il rivelatore dipende da un elemento riscaldato elettricamente (filamento di tungsteno o platino), la cui temperatura dipende dalla conducibilità termica del gas che lo circonda. He e H 2 buona conducibilità termica. La presenza di analiti (organici e inorganici) riduce la conducibilità termica del gas con conseguente temperatura filamento (segnale) Vantaggi: detector semplice e robusto, universale, range dinamico Svantaggi: bassa sensibilità
20 Rivelatori a cattura di elettroni (ECD): Risponde in maniera selettiva a composti organici contenenti alogeni. Il gas che entra nel rivelatore viene ionizzato da elettroni ad alta energia (radiazioni β) emessi da una lamina contenente 63 Ni radioattivo. La ionizzazione del gas di trasporto (solitamente N 2 ) genera un flusso di elettroni attratti dall anodo (corrente stazionaria). Quando le molecole dell analita ad elevata affinità elettronica entrano nel rivelatore, catturano gli elettroni riducendo la corrente Vantaggi: sensibilità elevata per composti alogenati Svantaggi: non sensibile per ammine, alcoli e idrocarburi
21 Derivatizzazione in GC La derivatizazzione è un processo che permette di modificare chimicamente un composto (es. altobollente) al fine di ottenere un nuovo composto le cui proprietà chimico-fisiche sono compatibili con l analisi GC La derivatizzazione permette le seguenti modifiche: - aumento la volatilità (elimina la presenza di gruppi polari come OH, SH, NH) - riduzione volatilità (permette l analisi di composti volatili a basso peso molecolare difficili da maneggiare e che coeluiscono con il solvente) - aumenta la stabilità - aumenta la sensibilità (inserimento di gruppi alogenati per ECD) Le principali reazioni di derivatizzazione sono: Silanizzazione Alchilazione acilazione
22 Derivatizzazione mediante silanizzazione La reazione di silanizzazione produce composti volatili e stabili termicamente. In tale reazione l H attivato viene sostituito con un gruppo trimetilsililico mediante una reazione di attacco nucleofilo (SN2; la reazione è guidata dal gruppo uscente) L agente silanizzante più semplice è il trimetilclorosilano (CH 3 ) 3 -Si-Cl (TMS-Cl). -OH -SH -COOH -NH 2 -NH CONH 2 TMS-Cl -OTMS -STMS -COOTMS -NHTMS, N(TMS) 2 -NTMS CONHTMS La reattività del gruppo funzionale verso la silanizzazione il seguente: Alcoli (primario> secondario>terziario) > fenolo > carbossile > ammina> ammide
23 Dato che i reattivi reagiscono con H 2 O, è necessario usare solventi anidri (la piridina è il solvente più utilizzato) Le colonne caratterizzate da idrogeni attivi (CARBOVAX) non sono compatibili con questi derivatizzanti principali agenti silalizzanti (CH3) 3 -Si-Cl (TMS-Cl). TMS-Cl TRIMETILCLOROSILANO (CH 3 ) 3 Si-imidazolo TMSIM (trimetilsililimidazolo) NB selettivo per OH, non reagisce con ammine (CH 3 ) 3 -Si-O-C(CH 3 )=N-Si(CH 3 ) 3 BSA (N,O-bis-trimetilsilil-acetamide) (CH 3 ) 3 -Si-N(C2H5)2 TMS-DEA (N-trimetilsilil-dietilamina)
24 Derivatizzazione mediante alchilazione La derivatizzazione mediante alchilazione riduce la polarità di molecole sostituendo idrogeni attivi con gruppi alchilici. La reazione si effettua con alogenuri alchilici o arilici, diazoalcani secondo le reazioni: R-NH 2 + 2Cl-R R-NR + 2HCl R-COOH + CH 2 N 2 RCOO-CH 3 + N 2 R-OH R-SH R-COOH R-NH 2 R-NH R-CONH 2 R-OR R-SR R-COOR R-NHR R-NR 2 R-COONR 2 Tra i principali agenti alchilanti: BF 3 in MeOH, dialchilacetali, pentafluorobenzilbromuri
25 Derivatizzazione mediante acilazione La reazione di acilazione riduce la polarità di gruppi amminici, idrossilici, tiolici e inserisce gruppi funzionali alogenati per ECD. La reazione di acilazione si utilizza per composti altamente polari come carboidrati e amino acidi. I reattivi utilizzati sono solitamente anidridi e alogenuri acilici I principali agenti derivatizzanti sono anidridi fluorinate (anidirde pentafluoropropionica e eptafluorobutirrica)
26 Esempi di separazioni Gas Cromatografiche -
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