CLASSIFICAZIONE DEI METODI CROMATOGRAFICI

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1 LE TECNICHE CROMATOGRAFICHE Le tecniche cromatografiche permettono la separazione e quantificazione i dei componenti di matrici complesse e trovano quindi numerosissime applicazioni in campo alimentare. Nei metodi cromatografici i componenti di una miscela si separano distribuendosi tra due fasi: una fase stazionaria (un solido oun liquido su supporto solido inerte) una fase mobile (gas o liquido) che fluisce in modo continuo su quella stazionaria. La separazione è dovuta principalmente alle relative affinità per la fase stazionaria. i Nella cromatografia liquida (LC) la fase mobile è un liquido, nella gas cromatografia (GC) la fase mobile èun gas.

2 CLASSIFICAZIONE DEI METODI CROMATOGRAFICI

3 PRINCIPI TEORICI DELLA CROMATOGRAFIA Esempio: separazione di un campione a tre componenti in una colonna chiusa. La fase stazionaria consiste di particelle solide porose contenute all interno di un tubo lungo e sottile (colonna). Nel passaggio attraverso la colonna ogni componente X si distribuisce fra la fase stazionaria (s) ela mobile (m): X m X s Il coefficiente i di ripartizione i (o di distribuzione) ib i del componente X è definito it come: Quale componente ha K maggiore? [X] s K X = [X] m A: il campione viene iniettato all entrata della colonna B D: la fase mobile fa spostare il campione attraverso la fase stazionaria i nte o del solve Fluss A B C D

4 t R t M Tempo di ritenzione (t R ): tempo necessario alla sostanza iniettata per essere eluita dall inizio all uscita della colonna. Tempo morto (t M ): tempo di ritenzione di un composto che non è trattenuto e che passa attraverso la colonna alla stessa velocità con cui fluisce la fase mobile lungo la colonna. Analogamente si definiscono i corrispondenti: Volume di ritenzione (V R R) ): volume di fase mobile necessario ad eluire l analita dall inizio all uscita della colonna. Volume morto (V M ): il volume di ritenzione di un composto che non è trattenuto tt t (corrisponde al volume di fase mobile che occupa la colonna).

5 Un parametro importante che viene usato molto spesso per descrivere la velocità di migrazione dell analita lungo la colonna è il fattore di capacità, k.. k' A = n totale di moli di A nella fase stazionaria n totale di moli di A nella fase mobile = K A V V M S Si dimostra che k può essere ricavato dai parametri del cromatogramma: k' A = t R t t M M Due sostanze saranno separabili se presentano valori diversi di k. La selettività quantifica l entità della separazione fra due specie: riguarda la capacità di un sistema cromatografico di distinguere fra due componenti ed è dipendente dalla distribuzione relativa delle specie fra la fase mobile e quella stazionaria, con (t R ) B >(t R ) A. k' B (tr ) B tm α = = k' (t ) t A R A M

6 Le molecole di un analita non si muovono lungo la colonna con la stessa velocità: la loro dispersione ha generalmente un profilo Gaussiano. Il centro del profilo (banda di eluizione) rappresenta la velocità media. I fattori che provocano deviazioni dal valore medio sono: 1. diffusione longitudinale (diffusione delle molecole dalla zona a maggiore concentrazione a quella a minore in direzione parallela all asse della colonna); 2. percorsi multipli; 3. trasferimento di massa tra mobile e fase stazionaria. fase

7 Parametri che descrivono quantitativamente l efficienza di una colonna (ampiezza dei picchi): 1) Altezza equivalente di piatto teorico H 2) Numero di piatti teorici N L= lunghezza colonna Piatto teorico: sezione della colonna che consente di realizzare un equilibrio reversibile di ripartizione di un componente fra le fasi. Poiché in cromatografia si ha una sequenza continua di stati di equilibrio e non vi è possibilità di realizzare una singola separazione, N ha un significato puramente matematico. Più elevato è il numero di piatti teorici, più grande è la probabilità di una separazione (migliore è la capacità di separazione della colonna). N è proporzionale alla lunghezza della colonna. N = L H Si può dimostrare che N = 16 tr W 2 W W = larghezza del picco L altezza equivalente al piatto teorico (H =L/N) consente di confrontare l efficienza di colonne di differente lunghezza.

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16 Variabili che influenzano l efficienza di una colonna: La principale variabile che influenza l efficienza di una colonna è la velocità di flusso lineare (cm/s) della fase mobile. Questa infatti influenza il tempo di contatto tra fase mobile e fase stazionaria. L altezza equivalente del piatto teorico, H, il parametro che descrive l efficienza della colonna, dipende d proprio dalla velocità di flusso della fase mobile (vedere Figura a lato). Sia in LC che in GC la velocità di flusso ottimale è piuttosto bassa. Quella ottimale della LC è inferiore a quella ottimale della GC. Per evitare tempi di analisi i troppo elevati, in LC si usano velocità un po maggiori di quella ottimale. La LC è caratterizzata da valori di H inferiori alla GC. In considerazione della lunghezza delle colonne (GC: >50 m; LC: <50 cm), la GC è comunque caratterizzata da valori più elevati di N, e quindi da migliore efficienza.

17 La risoluzione, R, èuna misura quantitativa della capacità di separare due analiti. Essa è ricavabile dal cromatogramma: R = [ ) (t ) ] 2 (tr W A B + W R B A = 2 Z W + W A B La risoluzione i caratterizza la bontà di separazione fra due picchi sia con riferimento i alla differenza fra i tempi di ritenzione (numeratore) sia riguardo all efficienza di separazione (denominatore). Una buona risoluzione può derivare sia da una buona efficienza (picchi molto stretti, elevato numero di piatti teorici) sia da una buona differenziazione del comportamento dei soluti (selettività) vedere equazione successiva.

18 Si può dimostrare che: R = 1 4 I B B + α 1 k N I α k 1 Effetto della selettività, dell efficienza e del fattore di capacità sulla risoluzione risoluzione scarsa picchi non separati buona risoluzione dovuta a buona efficienza i picchi stretti buona risoluzione dovuta a buona selettività picchi distanti risoluzione i scarsa dovuta ad un basso fattore di capacità

19 Le applicazioni della cromatografia vanno dall analisi qualitativa a quella quantitativa di miscele anche molto complesse. L analisi quantitativa sfrutta la misurazione dell altezza o dell area dei picchi. La misurazione i dell area è più affidabile in quanto non risente dell eventuale allargamento dei picchi in seguito a variazione delle condizioni di lavoro. I metodi di analisi sono tutti indiretti. Si costruisce prima una curva di calibrazione per ciascun analita e poi si ricava la concentrazione dell analita nella miscela in esame mediante interpolazione. i Il metodo dello standard interno è il più affidabile: una quantità nota di standard viene introdotta nelle soluzioni standard e nel campione in esame; il parametro analitico è quindi costituito dal rapporto tra le aree dello standard e dell analita (il metodo funziona solo se il picco dello standard è vicino ma separato da quello dell analita).

20 GASCROMATOGRAFIA La fase mobile è un gas. Le sostanze da separare (liquidi, idi solidi, gas) devono essere portate ad una temperatura sufficiente a renderle gassose o comunque portarle allo stato di vapore. Cromatografia di adsorbimento gas-solidosolido (fase stazionaria = solido adsorbente) Cromatografia di ripartizione gas-liquido (fase stazionaria = liquido che può essere supportato da un solido inerte o depositato sulle pareti della colonna) A differenza della LC, la fase mobile non ha effetto competitivo: il gas di trasporto serve solo per trascinare i componenti lungo la colonna.

21 He, Ar, N 2, H 2 SCHEMA DI UN GASCROMATOGRAFO\

22 Iniezione ed iniettori Il campione viene iniettato in quantità molto piccole (fino a 0,5 ml per impaccate, fino a 100 volte inf. per capillari). L entrata deve essere ad una temperatura sufficientemente elevata da permettere l evaporazione istantanea del campione e abbastanza grande da permettere al vapore di espandersi senza essere spinto indietro. Colonne gascromatografiche Si suddividono in impaccate e capillari. Le impaccate contengono particelle solide che vengono silanizzate, impaccate: per ridurre diatomee o diatomee la polarità mediante arricchimento superficiale i di gruppi metilici. i Le capillari sono tubi molto più sottili e lunghi (diametro = mm; lunghezza = m) in cui la fase stazionaria è depositata sulle pareti interne. Queste ultime hanno un elevato numero di piatti teorici elevata lunghezza. (anche ) grazie alla loro

23 Colonna capillare standard a fase legata

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25 Influenza della T sui t R : piùlatemperaturaèelevata piùil soluto tende a trasferirsi nella fase gassosa aumentando T diminuisce t R programma di T

26 Rivelatori Dovrebbero avere le seguenti proprietà: risposta lineare, stabilità, risposta uniforme per i diversi analiti (o comunque prevedibile epiù o meno selettiva). Il rivelatore ideale non esiste. Rivelatore a conducibilità termica: : si basa sul principio p del ponte di Wheatstone. controllo della corrente del filamento cella di riferimento cella del campione registratore attenuatore a ponte 4 filamenti: 2 sono circondati da gas di trasporto che fluisce in una corrente di riferimento, l altra coppia è circondata da gas di trasporto che proviene dalla colonna. Quando il ponte è in equilibrio tra i punti 1 e 2 non appare alcun segnale. Una variazione i della conducibilità termica del gas (dovuta all eluizione l i di analiti con il gas) produce un segnale tra 1 e 2.

27 Il Rivelatore a Ionizzazione di Fiamma è forse il più diffuso. Si basa sul fatto che molti composti organici, quando bruciano, in una fiamma, producono intermedi ionici che possono aumentare la conducibilità della fiamma stessa. È più sensibile di quello a conducibilità termica (fino a g/ml). + -

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29 HPLC = CROMATOGRAFIA LIQUIDA AD ALTA EFFICIENZA Vantaggi rispetto alla LC classica: velocità, risoluzione e sensibilità superiori. A B C A. crom.classica classica a colonna aperta riempita con particelle grandi, porose (d > 150 µm, D=20-50 mm, L= cm) B. HPLC con riempimento pellicolare (d =40-70 µm,, D=1-3 mm, L= cm) C. HPLC con riempimento di microparticelle (d =5-10 µm, D=2-6 mm, L= cm) d = diametro particelle; D = diametro colonna; L = lunghezza colonna

30 LC classica: dimensione delle particelle e diametro interno della colonna molto maggiori che nella HPLC; velocità di flusso molto basse; tempi di analisi lunghi. Cercando di aumentare la velocità del solvente, diminuiscono efficienza e risoluzione a causa del limitato trasporto di massa nei pori profondi e nei lunghi canali interparticellari. HPLC: impaccamento di dimensioni molto inferiori, compresso in colonne sottili; contropressioni maggiori; tempi d analisi contenuti. Per favorire il flusso della fase mobile è quindi necessario l uso di pompe ad alta pressione. Efficienza aumentata di e tempi di separazione diminuiti (miglioramento nei termini di trasporto di massa della fase stazionaria e della fase mobile).

31 SCHEMA DI CROMATOGRAFO HPLC COMPARTIMENTO TERMOSTATATO SERBATOIO SOLVENTE PRECOLONNA COLONNA REGISTRATORE FILTRO INIETTORE MISURATORE PRESSIONE POMPA RIVELATORE COLLETTORE DI FRAZIONI SPURGO

32 ELEMENTI DI CROMATOGRAFO HPLC Riserva di fase mobile (degasamento, eluizione isocratica o a gradiente) Sistema di pompaggio (pressioni fino a 6000 psi 400 atm) Sistema Sste adi iniezione e

33 Colonne (precolonne*, colonne analitiche, le più diverse) 3.0 and 4.6mm Standard Super-Link System HPLC Columns Rivelatori (Il rivelatore può essere selettivo verso una classe di analiti (es: solo i composti che assorbono nell UV, solo quelli fluorescenti, ecc) o universale (rivela tutti i componenti). In cromatografia liquida i rivelatori più usati sono: rivelatore UV-vis rivelatore a fluorescenza rivelatore a indice di rifrazione (RI) * Per rimuovere particolato, saturare la fase mobile con la stazionaria

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35 HPLC DI RIPARTIZIONE Fase stazionaria e mobile immiscibili l una con l altra: liquidi con proprietà solventi notevolmente diverse. Limitata a composti con valori di k' relativamente bassi perché la fase stazionaria deve essere un buon solvente per il campione, ma un cattivo solvente per la fase mobile: aumentando la forza del solvente per poter eluire composti con valori elevati di k' si aumenterà anche la solubilità della fase stazionaria; utile per risolvere differenze molto piccole nella solubilità degli analiti: l impiego della coppia fase stazionaria/fase mobile appropriata permette un alta selettività. I primi lavori con cromatografia di ripartizione usavano fasi stazionarie altamente polari (glicol, acqua,ecc.) e fase mobile non polare (esano, isopropiletere, ecc) ovvero operavano in fase normale. Attualmente, la fase stazionaria più usata è apolare (un idrocarburo) e quella mobile è un solvente relativamente polare (metanolo, acqua, acetonitrile, ecc.): questo tipo di cromatografia viene detto a fase inversa.

36 BPLC (Cromatografia a fasi chimicamente legate ) per i riempimenti della LC sono stati utilizzati tre tipi generali di legami chimici nei quali i gruppi Si-OH possono essere : 1. esterificati per reazione con alcoli producendo esteri di silicati 2. silanizzati per reazione con organocloro- o organoalcossi-silani 3. trasformati per clorurazione in Si-Cl e, in seguito, in Si-C per reazioni di Grignard o Wurtz, o qualche altra reazione tipica dei composti alogenati. gli impaccamenti sono più stabili nel tempo Si-OH + HOR R' Si-OH + Cl-Si-R R' Si-OH + SOCl 2 Si-Cl + R-Mg-Br Si-O-R + H 2 O R' Si-O-Si-R + HCl R' Si-Cl + SO 2 + HCl Si-R + MgClBr

37 HPLC DI ADSORBIMENTO Fase stazionaria: materiali adsorbenti come solidi porosi (silice, allumina) con area superficiale specifica da m 2 /g preparati in particelle di dimensioni appropriate. I gel di silice, per esempio, sono preparati facendo reagire silicato di Na con un acido minerale (es. HCl) e poi mediante polimerizzazione con formazione di un sistema tridimensionale di tetraedri di SiO 4. A seguito della disidratazione si forma un solido stabile poroso con terminazioni superficiali silanoliche e silossaniche. legami idrogeno gruppi ossidrilici isolati gruppi silossanici Le interazioni tra superficie adsorbente e soluto variano da non specifiche (forze di dispersione o di Van der Waals) a specifiche (interazioni elettrostatiche o interazioni tra accettori o donatori di elettroni -legami idrogeno).

38 Influenza della fase mobile: le interazioni implicano una competizione tra le molecole l dell analita lit e quelle della fase mobile per i siti di adsorbimento. I solventi possono essere distinti a seconda della loro forza di adsorbimento (serie eluotropica). idrocarburi alif. olefine idrocarburi arom. alogenuri solfuri eteri nitrocomposti esteri, aldeidi e chetoni ammine solfoni solfossidi ammidi ac. carbossilici acqua p o l a r i t à

39 ELUIZIONE A GRADIENTE Fase mobile debole : i componenti che sono ritenuti debolmente sono trattenuti e separati ma quelli ritenuti fortemente saranno eluiti in tempi troppo lunghi (e probabilmente con picchi troppo allargati). Fase mobile forte: saranno eluiti troppo rapidamente i componenti poco ritenuti, e saranno separati correttamente quelli trattenuti fortemente. Come separare tutti i componenti con K molto diversi? è necessario far variare la velocità di migrazione delle bande durante il corso dell analisi: eluizione a gradiente. L eluizione viene iniziata, ad esempio, con un solvente debole e la forza del solvente viene progressivamente aumentata. Leffetto L effetto complessivo è quello di una eluizione progressiva delle sostanze più fortemente ritenute e al tempo stesso, di una riduzione nella formazione di code. In GC il gradiente è un gradiente di temperatura. Perché?

40 SOLVENTE DEBOLE SOLVENTE FORTE FORZA INTERMEDIA GRADIENTE DI SOLVENTE

41 HPLC A SCAMBIO IONICO Per composti ionici, ionizzabili (acidi e basi organiche), e che possono interagire con gruppi ionici. Fasi stazionarie: polimeri funzionalizzate con gruppi carichi (solfonici e carbossilici come scambiatori ionici). Fase mobile: contiene generalmente un controione di carica opposta al gruppo ionico sulla superficie, in equilibrio con essa per formazione di una coppia ionica. dove: scambio cationico X + + R - Y + Y + + R - X + scambio anionico X - + R + Y - Y - + R + X - X = ione del campione Y = ione della fase mobile (controione) R = sito ionico sullo scambiatore Lo scambio dipende dal ph, temperatura, forza ionica, natura e concentrazione, dello ione competitore, ecc.

42 HPLC AD ESCLUSIONE È utile nel caso di miscele di analiti ad alto peso molecolare (polipeptidi, proteine, enzimi, carboidrati, ecc.). Fasi stazionarie: particelle di polimeri e silice a porosità uniforme e controllata. Il tempo di residenza degli analiti nella fase stazionaria i dipended dalle loro dimensioni. Se sono abbastanza piccole rimangono intrappolate nei percorsi multipli all interno delle particelle. Se sono troppo elevate non penetrano nella fase stazionaria e vengono eluite velocemente. Le tecniche che usano impaccamenti idrofili ed idrofobi sono note rispettivamente come gel- filtrazione e, rispettivamente, gel-permeazione. Si usano rispettivamente per specie polari e specie non polari. Fase mobile: la fase mobile ha la stessa polarità dell impaccamento (acquosa per impaccamenti idrofili e apolare per quelli idrofobi).

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44 In prima approssimazione, un problema analitico può essere condensato nell insieme delle seguenti informazioni: Analita Matrice Analisi qualitativa, quantitativa o di speciazione Livello di concentrazione Risoluzione (laterale, in profondità) Incertezza di misura (esattezza, precisione) Numero di campioni Tempi Costo Per aiutarsi nella selezione di una tecnica analitica potenzialmente idonea alla risoluzione del problema analitico, è utile esaminare le diverse classificazioni delle tecniche di analisi strumentale.