2. LA PURIFICAZIONE DI PROTEINE:

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1 2. LA PURIFICAZIONE DI PROTEINE: LA CROMATOGRAFIA Corso 240/350: Didattica di biochimica e biologia molecolare con laboratorio (2 CFU-16 ore) Marco Scocchi ( BIO/10-11)

2 LA PURIFICAZIONE DI PROTEINE Purificare significa ottenere solamente la nostra molecola di interesse Purificare una proteina per: determinarne la sequenza amminoacidica, studiarne la funzione, determinarne la struttura etc Processi di purificazione sfruttano differenze tra le proteine in: dimensione e forma Carica o distribuzione di carica Solubilità Attività biologica

3 PROCESSI DI SEPARAZIONE Precipitazione (solfato d ammonio, acetone) sfrutta la diversa solubilità Cromatografia ( vari tipi) sfrutta diversa carica, dimensione, idrofobicità, legami specifici etc Elettroforesi: carica, dimensione, pi Centrifugazione: forma, dimensione, densità

4 LA CROMATOGRAFIA La cromatografia è essenziale per la produzione di molecole ad alto valore per applicazioni terapeutiche come antitumorali, anticorpi monoclonali e proteine ricombinanti. E la tecnica di separazione di una miscela dove i composti da separare si distribuiscono tra due fasi immiscibili. Sulla base di interazioni chimiche e chimico-fisiche, i composti hanno diversa affinità nei confronti delle due differenti fasi con una diversa ripartizione tra le stesse.

5 FASE STAZIONARIA E FASE MOBILE Una delle fasi cromatografiche, definita stazionaria, è costituita da un letto statico (solido, gel, liquido) attraverso il quale si muove la seconda fase detta mobile ( liquido o gas). F mobile F stazionaria La prima costituisce il cosiddetto letto stazionario, solitamente un componente solido. La fase mobile determina invece una differenziazione delle tecniche in relazione al suo stato fisico: se è un gas si parla di gascromatografia, mentre se è un liquido di cromatografia in fase liquida.

6 COEFFICIENTE DI DISTRIBUZIONE/RIPARTIZIONE Il processo cromatografico può essere descritto come il risultato di una serie di equilibramenti, durante il movimento dei vari componenti della miscela attraverso il letto di fase stazionaria. La separazione conseguente è proporzionale alla differenza dei coefficienti di distribuzione o ripartizione dei vari componenti del campione tra le due fasi mobile e stazionaria. Il coefficiente di distribuzione è dato da: K d = [A] stazionaria / [A] mobile La scelta della fase mobile e stazionaria deve essere fatta in modo che le sostanze da separare abbiano diversa Kd

7 CROMATOGRAFIA IN FASE LIQUIDA A. Cromatografia su strato sottile (TLC) B. Cromatografia su carta C. Cromatografia su colonna A.La fase stazionaria è costituita da uno strato sottile, in genere silice, fissata su un supporto, generalmente una lastrina di vetro. B. Utilizza la carta come supporto della fase stazionaria, che può essere liquida o anche solida con particelle adsorbite sulla carta. C. Il sistema cromatografico è composto dalla: colonna che funge da contenitore della fase stazionaria, è costituita da materiali diversi: vetro, plastica e, in HPLC e in grosse colonne industriali, acciaio inossidabile. la fase stazionaria, il cuore del sistema: è la matrice su cui avvengono le diverse interazioni con le molecole biologiche del campione. Le caratteristiche fondamentali della matrice da valutare sono:

8 CARATTERISTICHE DELLA FASE STAZIONARIA Composizione: gel di silice, idrossiapatite, ecc. si hanno polimeri, sia sintetici sia naturali. Polisaccaridi: cellulosa, destrano, agarosio e chitosano. Gruppi funzionali: determina le interazioni con il campione, è la presenza di gruppi funzionali sulla matrice stessa che determina il tipo di cromatografia. Porosità: la trama più o meno fitta della rete del polimero ha influenza sia sulla stabilità meccanica che sulla capacità di permeazione delle molecole attraverso la struttura tridimensionale della matrice Granulometria: dimensioni delle particelle della matrice. Rigonfiamento: Quanta acqua legano e producono rigonfiamento, dipende dalla diversa idrofobicità

9 STRUMENTAZIONE DELLA CROMATOGRAFIA SU COLONNA Colonna in vetro o plastica con tappo o rubinetto. La pompa porta ad avere un flusso controllato della fase mobile in alternativa alla gravità Rilevatore: per rilevare in tempo reale la presenza delle sostanze eluite Raccoglitore: per recuperare i componenti separati Il Campione da caricare in colonna. I tubi, necessari per tutte le connessioni dell apparato cromatografico. Flusso per gravità A Eluente Lana di vetro Contenitor e eluente Colonna Materiale impaccato Uscita eluato (al rivelatore e/o al collettore di frazioni Flusso per azione di una pompa B Pompa Tappo Setti di nylon Tappo Eluente

10 PARAMETRI DEL CROMATOGRAMMA E il tracciato del segnale del rivelatore in funzione del tempo o del volume di eluente. Il tempo che intercorre tra l iniezione del campione e l uscita dell analita dalla colonna per raggiungere il rivelatore è detto tempo di ritenzione (t R ). Ciascun analita nel campione avrà differenti tempi di ritenzione. Il tempo che impiega la fase mobile ad attraversare la colonna è detto tempo morto (t M ). Analogamente: Volume di ritenzione (V R ): volume di fase mobile necessario ad eluire l analita. Volume morto (V M ) trattenuto (corrisponde al volume di fase mobile che occupa la colonna).

11 FATTORE DI RITENZIONE (CAPACITÀ) Il termine definito fattore di ritenzione (o capacità), k', è spesso utilizzato per descrivere la velocità di migrazione dell analita nella colonna. Per l analita A il fattore di ritenzione è dato da: A Fattore di ritenzione k = (t R -t M ) / t M t R e t M si ottengono direttamente dal cromatogramma. I fattori di ritenzione ideali sono compresi tra 1 e 5.

12 SELETTIVITÀ (FATTORE DI SEPARAZIONE) Per descrivere la separazione di 2 specie A e B in colonna è utile definire il la selettività (α): a = k ' B / k ' A Nel rapporto si pone al denominatore la specie che eluisce più velocemente in modo tale che sia sempre a > 1. Maggiore è questo rapporto e migliore sarà al separazione.

13 EFFICIENZA DI SEPARAZIONE E RISOLUZIONE Una buona risoluzione cromatografica significa una buona separazione tra i due picchi contigui Essa dipende dalla selettività a ma anche dall efficienza: l efficienza indica la capacità di un sistema cromatografico di eluire tutte le particelle di una specie chimica con la stessa velocità, in modo da formare bande e quindi picchi stretti. L efficienza dipende dal numero dei piatti teorici, che sono una rappresentazione teorica degli equilibramenti ai quali vanno incontro le molecole che attraversano il sistema cromatografico. Maggiore sarà il loro numero, ossia maggiore il numero di equilibramenti di ripartizione del soluto tra le due fasi, più elevata sarà l efficienza della colonna cromatografica. Bassa risoluzione Elevata selettività Elevata efficienza

14 CROMATOGRAFIA A ALTA PRESSIONE (HPLC) Diminuendo la dimensione delle particelle che costituiscono la fase stazionaria aumenta enormemente l efficienza delle colonne: aumenta la pressione necessaria a far scorrere la fase mobile: cromatografia ad alta pressione : HPLC Colonne per HPLC In pratica, la versione strumentale della cromatografia su colonna SEM Image Solas Silica

15 TIPI DI CROMATOGRAFIA A SECONDA DEL PRINCIPIO DI SEPARAZIONE prende in considerazione il tipo di interazione tra matrice e soluto - dimensione della molecola: gel filtrazione o cromatografia di esclusione; - carica: cromatografia a scambio ionico; idrofobicità: cromatografia di interazione idrofobica Adsorbimento e ripartizione interazione biochimica specifica: cromatografia di affinità; -

16 CROMATOGRAFIA A SCAMBIO IONICO Si basa sull adsorbmento reversibile di molecole su gruppi ionici con carica opposta alla propria. In base al gruppo funzionale posseduto si distinguono: 1. Scambiatori anionici 2. Scambiatori cationici SCAMBIO ANIONICO SCAMBIO CATIONICO i. scambiatori deboli (la percentuale di dissociazione varia molto intensamente con il ph) ii. scambiatori forti (ionizzati in un ampio intervallo di ph)

17 SEPARAZIONE MEDIANTE SCAMBIO IONICO Durante l eluizione, la fase mobile viene cambiata, gli ioni presenti nella fase mobile vengono separati gli uni dagli altri in base alla diversa affinità di ciascuno per i siti della fase stazionaria (cromatografia a scambio ionico)

18 CROMATOGRAFIA DI AFFINITÀ Il principio base della cromatografia di affinità è relativo a interazioni altamente specifiche delle biomolecole. Si ottiene utilizzando ligandi di natura biochimica: La molecola da purificare interagisce in maniera reversibile con un ligando covalentemente fissato sulla matrice insolubile della fase stazionaria. Si forma così un complesso tra molecola da purificare e ligando. Esempi: - anticorpo-antigene - Enzima-inibitore reversibile - Enzima-substrato - Acido nucleico-frammento acido nucleico complementare - Enzima-coenzima - Lectina-glicoproteina

19 CROMATOGRAFIA DI AFFINITÀ L eluizione della proteina della molecola di interesse puo essere ottenuto: 1) Cambiando la fase mobile in modo da interferire con il legame 2) Aggiungendo il ligando solubile in eccesso

20 CROMATOGRAFIA PER ESCLUSIONE MOLECOLARE (GEL FILTRATION) Cromatografia per gel filtrazione separa le molecole di soluto della fase mobile in base alle loro dimensioni, attraverso il letto di resina che funge da setaccio Fase molecolare. stazionaria Nell attraversare : granuli di la gel colonna le molecole sono Fase trattenute mobile: in solventi funzione della acquosi struttura/forma che assumono. Uso comune: separazione di proteine o acidi nucleici

21 GEL IDROFILICI PER SEC (SIZE EXCLUSION CHROMATORGAPHY) Sono gel idrofilici che utilizzano eluenti quali acqua tamponi alcoli. Destrano: carboidrato complesso per trasformazione del saccarosio ad opera di Leuconostoc mesenteroides. Costituito da unità di glucosio unite per più del 90%da legami 1,6-glicosidici. Sephadex: catene di destrano unite da ponti di glicerolo. Sephadex LH-20: da acilazione o alchilazione dei gruppi OH del destrano. Biogel : dalla copolimerizzazione di acrilammide e N,N - metilenbisacrilammide. Polimeri stirene-divinilbenzene: preparati per essere usati come setacci molecolari Gel lipofili per GPC Eluenti THF, DMF, toluene

22 PARAMETRI DELLA CROMATOGRAFIA PER ESCLUSIONE MOLECOLARE V e = vol di eluizione V e =V 0 +K d V i in cui Vi = V t -V 0 K d = V e - V o / V t -V 0 0< K d <1 K d è il coefficiente di distribuzione (0 1) che esprime la frazione del volume dei pori (Vi) accessibile alle molecole di una determinata sostanza.

23 CALCOLO DELLA MASSA MOLECOLARE DI UNA PROTEINA A PARTIRE DAL VALORE DI KD 6 1 Il V e è inversamente proporzionale al log della massa molecolare della proteina all interno del range di separazione

24 UTILIZZI DELLA CROMATOGRAFIA AD ESCLUSIONE Il frazionamento di miscele di proteine la risoluzione di monomeri proteici quando questi, sono organizzati in dimeri o aggregati, la determinazione del peso molecolare delle proteine. La dissalazione del campione: in una colonna con una matrice con un basso limite di esclusione, le proteine si muovono tutte o quasi attraverso il volume vuoto. Limitazioni della tecnica: volume del campione deve rimanere contenuto, i flussi molto bassi mentre le altezze delle colonne piuttosto alte.

25 Sephadex separation Pharmacia dextran

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