3. ELETTROFORESI DI PROTEINE

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1 3. ELETTROFORESI DI PROTEINE Corso 240/350: Didattica di biochimica e biologia molecolare con laboratorio (2 CFU-16 ore) Marco Scocchi ( BIO/10-11)

2 ELETTROFORESI PRINCIPI GENERALI Migrazione di particelle cariche sotto l influenza di un campo elettrico. Particelle con carica positiva migrano verso il catodo, quelle con carica negativa verso l anodo. d v q ddp (V): differenza di potenziale applicata tra gli elettrodi d: distanza tra gli elettrodi q: carica della molecola E (campo elettrico) = V/d ddp (V) v = Eq γ La molecola si muove verso l elettrodo di segno opposto con una velocità (v) che è proporzionale all entità del campo elettrico (E) e della sua carica (q) e inversamente proporzionale all attrito che incontra nel muoversi (γ coefficiente d attrito) m = q γ m = mobilità elettroforetica

3 FATTORI CHE MODIFICANO LA MOBILITÀ ELETTROFORETICA m = q γ La mobilità di una molecola è dovuta a : La sua carica Le sue dimensioni La viscosità del mezzo in cui si muove Quando l elettroforesi avviene in un gel: c e un effetto setacciante che può influenzare radicalmente la mobilità della molecola La separazione in elettroforesi può essere effettuata in base : Alla carica Alle dimensioni A entrambe

4 ELETTROFORESI DI BIOMOLECOLE La maggior parte delle molecole di interesse biologico (amminoacidi, peptidi, proteine, nucleotidi, acidi nucleici) possiedono gruppi ionizzabili e quindi, in dipendenza del ph, possono essere presenti in soluzione come specie cariche separabili tramite elettroforesi Supporti per: elettroforesi su gel: Agarosio Poliacrilammide Poliacrilammide: trama più compatta che quelli di agarosio Proteine: Poliacrilammide Acidi nucleici : Agarosio o Poliacrilammide (per piccole molecole)

5 GEL DI POLIACRILAMMIDE Copolimerizzazione radicalica di acrilamide (CH2=CHCONH2) con un agente in grado di stabilire legami crociati, solitamente N,N'-metilenbisacrilamide in presenza di un catalizzatore e di un iniziatore. Iniziatore: persolfato d'ammonio, dissolto in acqua forma radicali liberi S 2 O 8 2-2SO 4 -. Catalizzatore: TEMED (N,N,N',N'-tetrametiletilendiamina )

6 GEL DI POLIACRILAMMIDE Porosità del gel: dipende dalla concentrazione di acrilamide e metilenbisacrilamide. Viene espressa dai valori T e C T = concentrazione % acrilammide + poliacrilammide (w/v) C = rapporto percentuale tra bis-acrilammide e concentrazione totale di acrilammide +bis-acrilammide Variando T e C si possono modificare le dimensioni dei pori del gel e quindi le sue capacità di risoluzione.

7 L'APPARECCHIATURA PER L'ELETTROFORESI L'apparecchiatura per l'elettroforesi verticale è composta fondamentalmente da un alimentatore e una cella elettroforetica. L'alimentatore fornisce un flusso di corrente continua agli elettrodi applicati agli estremi della cella elettroforetica riempita tampone il campione migra verso l'anodo (+) o il catodo (-) a seconda della carica.

8 ELETTROFORESI DENATURANTE IN SDS Per fare in modo che le proteine si separino solo per un principio (dimensione) esse vengono fatte reagire con il detergente anionico denaturante SDS In questo modo tutte avranno lo stesso rapporto q/m e si separeranno in base al MW SDS forma micelle e lega le proteine in rapporto stechiometrico T = 6-8% T = 8-10% kda 80 kda-50 kda T = 15-20% 45 kda-20 kda

9 ELETTROFORESI IN PRESENZA DI SDS I campioni vengono trattati con una soluzione tamponata (tampone di caricamento) contenente: SDS, un riducente (β-mercaptoenanolo) un addensante un colorante - SDS, calore Proteine + SDS Le proteine sono visualizzate tramite l aggiunta di un colorante (Blue Coomasie)

10 I GEL IN SDS SONO DISCONTINUI Gel di impaccamento (stacking) che concentra il campione in una stretta banda sopra e un gel sottostante di separazione

11 STIMA DELLA MASSA MOLECOLARE DI UNA PROTEINA ATTRAVERSO SDS -PAGE Stima non assoluta, precisione di circa il 5% Alcune proteine migrazione anomala glicoproteine, proteine con abbondanza di a.a carichi come istoni Mobilità elettroforetica relativa = Rf = d/l d= distanza percorsa dalla proteina l= distanza percorsa dal tracciante

12 L esperimento