Elettroforesi proteine ed acidi nucleici

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1 Elettroforesi proteine ed acidi nucleici Flavia Frabetti Tecnici di laboratorio 2010/2011 ELETTORFORESI metodo fisico di separazione che sfrutta la mobilità elettroforetica di molecole cariche, sottoposte ad un campo elettrico si realizza attraverso l utilizzo di un sistema elettroforetico matrice di gel cella elettroforetica alimentatore (in cui applicare voltaggio o intensità di corrente costante) tamponi salini si possono studiare sia gli acidi nucleici (DNA e RNA) sia le proteine 1

2 Matrice di gel serve da setaccio molecolare e consente la separazione Come si forma il gel? può essere fatto di polimeri agarosio o poliacrilamide Gel di agarosio: pesare l agarosio misurare il buffer (TBE/TAE) bollire l agarosio in buffer versare il gel nella vaschetta allestita Gel di acrilamide: miscelando acrilamide e bis-acrilamide che formano un polimero complesso a maglia* Gel di acrilamide utili soprattutto per la separazione e caratterizzazione di proteine di solito in sistemi verticali, poiché se ne fanno lastre di 0,2-0,4 mm i cui pozzetti non sarebbero caricabili in un sistema orizzontale la velocità di migrazione elettroforetica attraverso i gel dipende principalmente da 4 parametri taglia molecolare del peptide concentrazione di acrilamide conformazione della molecola (denaturata o meno) voltaggio 2

3 Spesso si procede in condizioni denaturanti - SDS PAGE PAGE = Poli-Acrilamide Gel Elettroforesi delle proteine è di norma realizzata facendo polimerizzare la poliacrilamide tra due vetri piatti e la corsa viene eseguita in un sistema verticale SDS = detergente (sodio-dodecil-solfato) carico - well= pozzetto lane= corsia catodo anodo supporto di plastica campione pozzetti con i campioni tampone tampone DENATURAZIONE DELLE PROTEINE: preparazione del campione (sample) con proteine denaturate bollitura proteina tetramerica proteina monomerica bollitura peptidi connessi da ponti disolfuro peptidi separati SDS = Sodio Dodecil-Solfato (detergente anionico) BME = β- mercaptoetanolo (riducente) 3

4 Scelta della % di acrilamide in rapporto alla taglia molecolare delle proteine Acrilamide(%) Intervallo di separazione dei peptidi (in kilodalton) I fase: separazione per carica ph basico II fase: separazione dimensionale ph acido ELETTROFORESI BIDIMENSIONALE SU GEL o ISOELECTROFOCUSING punto isoelettrico (pi): il ph al quale la carica netta di una proteina è nulla per un bilancio tra + e -, qui La proteina non sarà più soggetta a migrazione elettroforetica Dal Chieffi riquadro 2.2 pag:

5 Rivelazione della separazione elettroforetica: tramite colorazione aspecifica di tutte le proteine della miscela (es. con comassie blue o silver-stain) trasferimento, anche qui elettroforetico, su opportune matrici di nitrocellulosa attraverso la tecnica del Western Blotting per analisi più fini, specifiche 1- riconoscimento mediante autoradiografia di proteine marcate con radioisotopi 2- riconoscimento immuno-enzimatico utilizzando anticorpi specifici 1- riconoscimento mediante autoradiografia di proteine marcate con radioisotopi consente di evidenziare proteine neo-sintetizzate ed analizzare il turn-over proteico (esperimenti di pulse-chaise) l isotopo radioattivo più usato è lo zolfo 35 S (emivita di 87gg) metionina cisteina 5

6 2- riconoscimento immuno-enzimatico utilizzando anticorpi specifici consente di riconoscere una specifica proteina di interesse consta di diverse fasi schematizzabili in: a) elettro-trasferimento dal gel ad una membrana di nitrocellulosa b) rivelazione con l anticorpo (colorazione immuno-enzimatica) a) elettro-trasferimento dal gel ad una membrana di nitrocellulosa trasferimento delle proteine carta imbevuta di tampone carta imbevuta di tampone proteina di interesse 6

7 b) rivelazione con l anticorpo (colorazione immuno-enzimatica) - fasi procedurali la membrana viene saturata da proteine inerti anticorpi I legano l antigene anticorpi II legano gli anticorpi I sviluppo della colorazione enzimatica Verifica qualitativa e quantitativa acidi nucleici Spettrofotometro Analisi a λ= 260 nm Si misura la ssorbanza o densità ottica O.D. 1 O.D. 50 µg DNA 1 O.D. 40 µg RNA 1 O.D. 30 µg oligonucleotidi λ= 280 nm proteine 260/280 > 1,8 ( 2) è abbastanza puro Nanodrop 7

8 Gel di agarosio utili per la separazione e caratterizzazione di acidi nucleici di solito in sistemi orizzontali la velocità di migrazione elettroforetica attraverso i gel di agarosio dipende principalmente da 4 parametri taglia molecolare del DNA o RNA concentrazione di agarosio conformazione della molecola voltaggio Allestimento della tecnica elettroforetica su gel orizzontali di agarosio (schema) preparazione gel Campione (sample)viene diluito in un tampone di caricamento (loading buffer) che contiene 2 coloranti per tracciare la corsa: Blu di bromofenolo (Bb) 300 bp Xilene cianolo (Xc) bp ed anche glicerolo per appesantire il campione caricamento campioni (Ø 5mm/well) rilevazione connessione ed accensione 8

9 Corsa e rilevazione su gel orizzontali di agarosio - procedure Riempire la vaschetta con il buffer Caricare i campioni sul gel Accendere l alimentatore (parte la corsa del gel) Analisi del gel al transilluminatore Fine della corsa Risultato std molecolari o markers a dimensione nota Le molecole più grandi hanno V minore, per > attrito e perché vengono intrappolate di più nelle maglie del gel Bande luminose per via del bromuro di etidio (intercalante del DNA) che fluoresce ai raggi UV e si vede banda giallo-arancio Limite di sensibilità 1-5 ng di DNA 9

10 Taglia molecolare del DNA o RNA e migrazione Agarosio (%) Intervallo di separazione di DNA lineare (in Kb) Di norma si applica un voltaggio di 5 Volt /cm di lunghezza della vaschetta Il voltaggio (V) tende a variare durante la corsa in rapporto alla variazione nella distribuzione delle cariche e del ph Durante la corsa la resistenza (R) aumenta V= i x R per avere una migrazione costante deve aumentare anche V Uniformità di calore e ph: le corsie periferiche sono più fredde (effetto smile) di norma evitato con tubicini che collegano parte negativa e positiva 10

11 I gel di poliacrilamide per separare acidi nucleici sono usati se: si devono separare piccoli oligonucleotidi < 100 basi, si possono risolvere anche oligo diversi anche per 1 nucleotide sono di solito a basse concentrazioni di acrilamide (<=6%) e contengono Urea (6M) Stima della dimensione di una molecola in rapporto alla mobilità elettroforetica di std di dimensione nota (questo vale anche per le proteine) Il DNA è una molecola che ha un rapporto carica/massa costante e dunque uniformità nella separazione 11

12 Gel controllo DNA markers a dimensione nota pozzetti frammenti di DNA genomico (50-100Kb) La quantità di DNA attesa è di 7 pg per cellula umana diploide Es. globuli bianchi 6.000/µl ovvero /ml x 7 pg= pg = ng= 42 µg GEL DNA APOPTOSI ladder (scala) apoptotico 12

13 Gel controllo RNA 28S (5000 basi) 18S (2000 basi) 5S+tRNA(100 basi) L 80-85% di RNA cellulare e costituito da rrna, circa il 10% da trna E tra 1-5 % da decine di migliaia di mrna diversi Gel degradazione RNA, contaminazione DNA effetto SMEAR striscia 13