SDS-PAGE/Western blot

Transcript

1 SDS-PAGE/Western blot preparare 2 gels: 7.5% di acrilamide, SPACERS 1.5 mm. Uno verrà utilizzato per il trasferimento su nitrocellulosa, l altro colorato con il blu di coomassie. caricare i campioni dell exp di immunoprecipitazione (IP) secondo il seguente schema: Gel #1: trasferire Std 5µl 10µl 5µl 10µl 10µ g 20µg 10µg 20µg STD 5µl IP # 1 (1:100) IP # 2 (1:500) Non IP # 1 (1:100) Non IP # 2 (1:500) 5µl Gel #2: colorare Std 25µl 25µl 25µl 25 µl STD 5µl IP Non IP IP Non IP 5µl Campione #1 Campione #2 eseguire la corsa elettroforetica; durante la corsa, preparare il tampone di trasferimento (1L): 3.03 g TRIS, g glicina, 800 ml cold dh 2 O, 200 ml MeOH. Porre il tampone a 4 C tagliare la membrana e la carta da filtro delle dimensioni del gel. Porre la membrana ad idratare in dh 2 O. Indossare sempre i guanti per evitare contaminazioni della membrana; finita la corsa, togliere i gels dai supporti

2 Gel #2: mettere in colorante per minuti. Poi decolorare o/n in decolorante; Gel #1: equilibrare in tampone di trasferimento per 10 minuti insieme a membrana, carta da filtro e spugne; preparare il sandwich sul lato nero: spugna, carta da filtro, gel, membrana, carta da filtro, spugna; trasferire 1h 100V costante, in ghiaccio; alla fine del trasferimento, lavare la membrana in TBS per eliminare eccesso di metanolo; incubare le membrane per 1h RT in 20 ml blocking solution: TBS + 5% latte; incubare o/n a 4 C con anti-stat1 rabbit polyclonal diluito 1:2000 in TBS + 5% latte; recuperare l anticorpo e congelarlo a - 20 C. Puo essere riutilizzato per ulteriori western blot; 3 lavaggi da 10 minuti ognuno in TTBS (TBS % tween 20) per eliminare l anticorpo non legato; incubare 1h a RT con goat-anti-rabbit diluito 1:4000 intbs % tween % latte; 2 lavaggi da 10 minuti in TTBS (TBS % tween 20) per eliminare l anticorpo non legato; 1 lavaggio da 10 minuti in TBS; incubare per 1 minuto la membrana in ECL; catturare il segnale ponendo la membrana su lastra, successivamente sviluppata e fissata; analisi dei risultati ottenuti.

3 Tamponi Necessari: SDS-PAGE ACRILAMIDE (100 ml): ACRILAMIDE 30% (w/v) BIS-ACRILAMIDE 0.8% (w/v) FILTRARE NB: l acrilamide è tossica, usare guanti e mascherina per effettuare le pesate. Maneggiare la soluzione sempre con i guanti. TRIS-HCl 1.5 M, ph 8.8, (100 ml) TRIS-HCl 0.5 M, ph 6.8, (100 ml) AMMONIO PERSOLFATO 10% (w/v), preparare al momento dell uso. TAMPONE DI CORSA (1 lt): GLICINA 14.4 gr TRIS SDS 3.02 gr 1 gr SAMPLE BUFFER (2X): TRIS 0.1 M, ph 6.8 GLICEROLO 20% (v/v) SDS 4% (w/v) BROMOFENOLO Prima dell uso, aggiungere ad una aliquota 20 ul/ml MERCAPTOETANOLO.

4 Tamponi Necessari: Immunoblotting Tampone di trasferimento (1L): 3.03 g Tris g glicina 20% metanolo (la percentuale puo diminuire per proteine ad alto peso molecolare) ice-cold dh 2 O. TBS (2L): g Tris g NaCl dh 2 O, ph 7.4 Soluzione di Blocking: TBS + 5% latte NB: la stessa soluzione viene utilizzata per diluire l anticorpo primario. Soluzione per i lavaggi: TBS % tween 20 lavare con circa 70 ml per ogni membrana, agitando energeticamente. Soluzione per anticorpo secondario: TBS % tween % latte

5 LMW calibration kit Phosphorylase b Albumin Ovalbumin Carbonic anhydrase Trypsin inhibitor α-lactalbumin

6 Equazioni relative all elettroforesi: E: forza del campo elettrico V: voltaggio applicato d: distanza tra gli elettrodi v: velocità di una molecola carica q: carica della molecola Forma della molecola f: coefficiente frizionale Massa della molecola E = V/d v = Eq/f MOBILITA : µ = v/e v = µ E µ E = Eq/f µ = q/f ELETTROFORETICA

7 1. SDS (SODIO DODECIL SOLFATO) CONDIZIONI DENATURANTI (SDS-PAGE) q/massa = per tutte le proteine 2.AGENTI RIDUCENTI MSH (mercaptoetanolo) DTT (ditiotreitolo) 3.RISCALDAMENTO A 100 C MOBILITA ELETTROFORETICA (µ)= q/f (massa e forma) = q/massa = PER TUTTE LE PROTEINE

8 RIVELAZIONE DELLE PROTEINE SU GEL COLORAZIONE con COOMASSIE BRILLIANT BLUE R-250 IL COLORANTE E SCIOLTO IN ACIDO ACETICO E METANOLO 30 min COLORAZIONE h DECOLORAZIONE SENSIBILITÀ: da µg fino a 10 ng COLORAZIONE ad ARGENTO (SILVER STAIN) SI BASA SULLA DEPOSIZIONE DI Ag + SULLE PROTEINE 3-5 h COLORAZIONE (dimensione-spessore del gel) SENSIBILITA : fino a 0.1 ng (100 volte più sensibile)

9 DETERMINAZIONE DEL PESO MOLECOLARE TRAMITE SDS-PAGE

10 ISOELETTROFOCALIZZAZIONE (IEF) (SEPARA SOLO IN BASE ALLA CARICA NETTA DELLE PROTEINE) E UTILE NELLO STUDIO DI: DETERMINAZIONE DEL PUNTO ISOELETTRICO MODIFICAZIONI POST-TRADUZIONALI (FOSFORILAZIONE) ISOENZIMI CHE DIFFERISCONO DI POCHI AMINOACIDI

11 I DIMENSIONE IEF GEL ph 9 pi decrescente 2D-GEL O BIDIMENSIONALE ph 3 PM decrescente PM decrescente pi decrescente II DIMENSIONE SDS-PAGE