Capitolo 5. Materiali e metodi. 5.1 Animali. 5.2 Stabulazione

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1 Capitolo 5 Materiali e metodi 5.1 Animali Gli esemplari di gambero di fiume turco, Astacus leptodactylus, della lunghezza di circa cm, sono stati acquistati da un rivenditore locale il quale li importa direttamente dal luogo di allevamento in Turchia. 5.2 Stabulazione Dopo un periodo di acclimatazione di una settimana, nel quale gli animali vivevano in vasche da 120 litri, e venivano nutriti ogni due giorni, sono state separate le femmine dai maschi e le prime divise in tre gruppi, omogenei per grandezza, e numerate. Ogni gruppo sperimentale è stato messo in un apposita vasca separata dalle altre e della capacità di 70 litri ciascuna. Ciascun animale chiuso in un ulteriore gabbia formata da rete plastica della grandezza di 30x30 cm. L isolamento di ciascun animale permetteva una distribuzione omogenea del mangime e quindi una standardizzazione dell a-

2 54 Materiali e metodi limentazione, nonchè un miglior controllo degli animali, in caso ad esempio di muta coincidente (mutando carapace gli individui perdono la marcatura e quindi non sono riconoscibili). La circolazione dell acqua nelle tre vasche era continua, con un flusso di circa 10 litri all ora. L acqua era di provenienza diretta dall acquedotto e non veniva previamente trattata, la temperatura era costante sui C. I fotoperiodo artificiale era regolato su 10 ore di luce e 14 di oscurità. 5.3 Alimentazione I gamberi venivano alimentati ogni due giorni alternativamente con i due mangimi della Sera, Viformo e O-Nip. La dose individuale era di un tab, o pastiglia, ciascuno, distribuzione omogenea resa possibile dall isolamento di ciascun individuo in gabbie singole. 5.4 Trattamento Le femmine, sono state divise in tre gruppi omogenei: controlli, epeduncolate e trattate con anticorpo antigih. Ad ogni gruppo appartenevano 12 individui circa della stessa grandezza (10 12 cm). Gli animali sono stati misurati e numerati (mediante pennarello indelebile sul dorso del carapace). Il trattamento è iniziato con l epeduncolazione e le prime iniezioni di ormone il 23 maggio e si è concluso il 14 luglio, data dell ultimo prelievo e della dissezione degli animale per prelevare ovari e epatopancreas. Iniezioni e prelievi di emolinfa venivano effettuati con siringhe sterili da 1 ml nel tessuto sottostante le giunture tra i segmenti addominali.

3 5.4 Trattamento Epeduncolati monolateralmente Gli individui da epeduncolare sono stati messi previamente in ghiaccio per alcuni minuti onde indurre uno stato di anestesia. Quindi si è proceduto alla rimozione del peduncolo (per scelta sempre quello destro) tramite taglio effettuato mediante forbicine sterili. Il taglio veniva operato alla base del peduncolo stesso per eliminare tutte le strutture sedi della sintesi ormonale. Così operati i gamberi venivano rimessi immediatamente in acqua nelle rispettive gabbie senza nessun ulteriore trattamento per favorire la cicatrizzazione. A parte i prelievi settimanali gli animali appartenente a questo gruppo non erano soggetti ad ulteriori trattamenti Trattati con anticorpo antigih L anticorpo utilizzato è un anticorpo policlonale sviluppato in coniglio contro GIH di scampo, Nephrops norvegicus [20]. La concentrazione iniziale dello stesso era di 50 µg su millilitro. Tre volte a settimana gli animali del gruppo venivano iniettati con una soluzione di 4 µl di anticorpo portati a 100 µl in PBS (concentrazione finale di 2 µg/ml). Esattamente come gli altri due gruppi subivano un prelievo di emolinfa una volta alla settimana. I prelievi avvenivano immediatamente prima delle iniezioni Controlli Al gruppo di controllo venivano iniettati 100 µl di PBS tre volte la settimana (il lunedì, il mercoledì ed il venerdì) esattamente come al gruppo dei trattati veniva iniettato l anticorpo. Ad ogni componente ciascun gruppo una

4 56 Materiali e metodi volta alla settimana (il mercoledì) venivano prelevati circa 500 µl di emolinfa (il prelievo veniva effettuato prima delle iniezioni). 5.5 Mortalità Dei 12 individui di partenza di ciascun gruppo ne sono rimasti 9 nel gruppo di controllo (mortalità del 25%), 10 nel gruppo dei trattati con l ormone (mortalità del 16.67%) mentre nessun animale del gruppo degli epeduncolati è morto durante l esperimento. 5.6 Prelievo dell emolinfa Una volta alla settimana (il mercoledì) ai gamberi di ciascun gruppo veniva prelevata l emolinfa nella quantità di circa 500 µl. In seguito a centrifugazione ( giri per 1 minuto), necessaria per separare la parte cellulare responsabile della coagulazione, il surnatante veniva diviso in due aliquote, facendo attenzione ad eliminare il pellet. All aliquota destinata all analisi elettroforetica veniva aggiunta un antiproteasi ed entrambi i campioni venivano, previa etichettatura, conservati a -20 C fino al successivo utilizzo. Alla fine sono stati raccolti nove campioni di emolinfa per ciascun gambero nelle seguenti date: 23/05, 27/05, 03/06, 10/06, 17/06, 24/06, 01/07, 08/07, 14/07.

5 5.7 Dissezione Dissezione Alla fine del trattamento tutti gli animali soggetti alla sperimentazioni sono stati sacrificati, per poter effettuare la pesatura degli ovari e degli epatopancreas. Una parte di questi organi è stata pure prelevata e conservata in fissativo Bouin, acido picrico in soluzione acquosa satura, formalina ed acido acetico glaciale (15:5:1), per eventuali analisi microscopiche in caso di risultati evidenti. Per lo stesso motivo sono stati prelevati anche un peduncolo dai controlli e dai trattati nonchè quello restante degli epeduncolati. 5.8 Analisi chimica dell emolinfa Le analisi chimiche per determinare le concentrazioni nell emolinfa, di proteine, glicemia, colesterolo e trigliceridi, sono state effettuate con lo strumento Screen Point della Hospitex Diagnostics che si basa su un sistema di lettura fotometrica. I reagenti da utilizzare si trovano già in fase predosata e l unica accortezza risiede nella taratura dello strumento prima dell utilizzo. La misura della densità è stata fatta tramite rifrattometro ottico. 5.9 Analisi elettroforetica dell emolinfa L analisi elettroforetica dell emolinfa è stata condotta con due metodologie, l SDS-PAGE e il PhastSystem TM. Gli standard di peso molecolare utilizzati sono stati: miosina (200 kda), β-galattosidasi (116.3 kda), fosforilasi B (97.4 kda), albumina del siero bovina (BSA) (66.3 kda), glutammico deidrogenasi (55.4 kda), lattico deidro-

6 58 Materiali e metodi genasi (36.5 kda) e carbonico deidrogenasi (31.0 kda). Quando necessario, per eventuali confronti, ai campioni degli individui femmina da analizzare è stato aggiunto anche un campione di emolinfa prelevata da un maschio della stessa specie SDS-PAGE L SDS-PAGE (polyacrylamide gel electrophoresis, elettroforesi in gel di poliacrilammide) permette, denaturando le proteine con il detergente anionico sodio dodecil solfato (SDS), la separazione delle stesse esclusivamente sulla base delle dimensioni delle catene polipeptidiche, quindi sul loro peso molecolare. Le condizioni denaturanti separano inoltre le varie subunità che costituiscono le proteine Preparazione del gel Stacking gel (4%) ml H 2 O 500 µl Tris HCl 0.5M ph µl SDS 10% 200 µl Acryl/Bis 40% (37.5:1) 4 µl TEMED 4 µl APS 25% 2 ml volume finale

7 5.10 SDS-PAGE 59 Running gel (7.5%) ml H 2 O 1.25 ml Tris HCl 1.5M ph µl SDS 10% ml Acryl/Bis 40% (37.5:1) 5 µl TEMED 10 µl APS 25% 5 ml volume finale Tamponi SDS Running Buffer (10X) 30 g Tris Base 144 g Glicina 10 g SDS 1 l volume finale Sample Buffer (2X) 10 ml Tris HCl 0.5M ph ml Glicerolo 16 ml SDS 10%

8 60 Materiali e metodi ml Acryl/Bis 40% (37.5:1) 4 ml β-mercapto-etanolo 200 µl BBF 0.05% 2 ml H 2 O 40 ml volume finale Preparazione dei campioni I campioni di emolinfa a cui era stata aggiunta antiproteasi sono stati scongelati e portati alla diluizione scelta (1/20) in PBS. Quindi si è aggiunto un egual volume di Sample Buffer 2X e sono stati bolliti per 8 minuti. In ciascun pozzetto venivano caricati 5 µl di campione così preparato Corsa elettroforetica Il voltaggio applicato per lo stacking era di 80V e veniva mantenuto per circa 30 minuti. Per il running era invece di 120V e la corsa veniva protratta per 80 minuti circa. In ogni caso le valutazioni sui tempi necessari si facevano osservando il fronte di migrazione (colorante presente nel buffer) Colorazione argentica L uso di questa tecnica di colorazione è stato reso necessario in quanto risulta molto sensibile a concentrazioni basse di proteina. L uso di alte diluizioni di emolinfa, e di conseguenza basse concentrazioni di proteina, è dovuto

9 5.11 Colorazione argentica 61 al fatto che la maggior parte delle proteine dell emolinfa è data dall emocianina che durante elettroforesi migra in una grossa banda, tra i 70 e gli 80 kda circa, che tende a coprire le bande delle altre proteine Protocollo colorazione argentica 100 ml di fissativo per ml milliq per ml milliq per ml 0,02% Na 2 S 2 O 3 per ml milliq per ml milliq per ml 0,1% AgNO 3 per ml milliq per ml di sviluppo per ml di sviluppo per ml acido citrico 0,115M per ml milliq per ml milliq per 30 fissativo: 1 in base allo sviluppo desiderato

10 62 Materiali e metodi 40% alcool metilico; 13,5% formalina. sviluppo: 3% sodio carbonato; 0,05% formalina; 0,000016% Na 2 S 2 O 3. Le quantità di reagenti usati permettono la colorazione di un gel alla volta. Aggiunti i reagenti il gel va mantenuto in continuo movimento tramite agitatore. La fase dello sviluppo viene bloccata al raggiungimento della colorazione desiderata aggiungendo il bloccante (acido citrico) direttamente alla soluzione di svuluppo Protocollo SilverQuest TM Silver Staining Kit 100 ml milliq per ml di fissativo per ml etanolo, 70 ml milliq per ml etanolo, 70 ml milliq per ml etanolo, 10 ml sensibilizzante, 60 ml milliq per ml etanolo, 70 ml milliq per ml milliq per 30 2 lo sviluppo non viene bloccato immediatamente

11 5.12 PhastSystem TM ml milliq per 10 1 ml colorante, 99ml milliq per ml milliq per 1 10 ml di sviluppo, 1 goccia di enhancer, 90 ml milliq per ml di bloccante per ml milliq per 10 Le quantità di reagenti indicate sono necessarie per la colorazione di un solo gel alla volta. E indispensabile l utilizzo contenitori di vetro bel lavati e il mantenimento in costante agitazione del gel durante tutti i passaggi PhastSystem TM Il sistema PhastSystem TM della Pharmacia permette una separazione elettroforetica e successiva colorazione automatizzate e rapide. Lo strumento è composto da due unità, la Separation and Control Unit, che permette la separazione elettroforetica nonchè la programmazione dei vari passaggi, e la Developing Unit, dove avviene la colorazione dei gel Elettroforesi I gel di poliacrilammide del sistema PhastGel TM sono già pronti e misurano 43 x 50 x 0.45 mm, si sono utilizzati supporti PhastGel Homogeneous in base allo sviluppo desiderato 4 aggiunto direttamente allo sviluppo

12 64 Materiali e metodi (concentrazione omogenea di poliacrilammide al 7.5%). Il buffer è sostituito da dei blocchi di agarosio, PhastGel Buffer Strips SDS (0.20 M tricina, 0.20 M Tris, 0.55% SDS, ph 8.1 ). Il programma di separazione utilizzato è quello standard per gel SDS al 7.5%. I campioni, fino ad 8 per ogni gel, venivano depositati con gli appositi applicatori capaci di caricare sul gel contemporaneamente 1 µl di ciascun campione. La preparazione dei campioni era identica a quella per l SDS- PAGE (paragrafo ), cambiava solo la diluizione dell emolinfa, in questo caso era di 1 a 30 sempre in PBS. La corsa, non essendo sempre ben distinguibile il fronte di migrazione, veniva fermata al raggiungimento di 60 AVh (dopo circa 30 minuti) Colorazione argentica Protocollo per la colorazione argentica modificato e basato sul PhastGel TM Silver Kit da utilizzare con il PhastSystem TM. Il PhastSystem TM presenta una celletta dove possono essere colorati fino a due gel alla volta. I reagenti vengono pompati nella cella tramite appositi tubi direttamente dalle bottiglie e tenuti alla temperatura voluta per il tempo necessario (il tutto è programmabile dall unità di controllo). 50 ml etanolo, 10 ml acido acetico, 40 ml milliq a 50 C per ml glutaraldeide 25%, 66.7 ml milliq a 50 C per ml milliq a 50 C per ml milliq a 50 C per 2

13 5.13 Analisi statistica g AgNO 3, 100 ml milliq a 40 per ml milliq a 30 C per ml milliq a 30 C per 30 5 g sodio carbonato, 50 µl formaldeide 37%, 200 ml milliq a 30 C per 30 5 g sodio carbonato, 50 µl formaldeide 37%, 200 ml milliq a 30 C per 4 5 ml acido acetico, 95 ml milliq a 50 C per ml glicerolo, 10 ml acido acetico, 87.5 ml milliq a 50 C per 3 Le soluzioni vanno preparate di volta in volta per evitare precipitazioni ed eventuali contaminazioni (per la pulizia dei tubicini il sistema prevede infatti un risciacquo che avviene direttamente nelle soluzioni utilizzate) Analisi statistica Test t di Student Questo particolare test viene utilizzato per il confronto delle medie di due campioni dipendenti con una differenza attesa (nel nostro caso confronti tra due gruppi con due trattamenti diversi o tra un controllo e un trattamento). Sono condizioni di validità della distribuzione t di Student, e quindi dei test che la utilizzano: che la distribuzione dei dati sia normale e che le osservazioni siano raccolte in modo indipendente. Condizioni sempre verificate prima della sua applicazione. Il metodo utilizzato prevede la distribuzione a due code e richiede la condizione di omoschedasticità, cioè che le due varianze

14 66 Materiali e metodi siano statisticamente uguali. I campioni sono dipendenti in quanto i dati sono auto-appaiati (misure effettuate sullo stesso animale) ANOVA L analisi della varianza (ANOVA, ANalysis Of VAriance) ad un criterio di classificazione, o ad una via, permette il confronto simultaneo tra le medie di più di due gruppi, formati da soggetti sottoposti a trattamenti differenti o con dati raccolti in condizioni diverse. Al fine di evidenziare tutte le possibili differenze significative tra le medie non è corretto ricorrere al test t di Student per ripetere l analisi tante volte quante sono i possibili confronti a coppie tra i singoli gruppi. Con il metodo del t di Student si utilizza solo una parte dei dati e la probabilità α prescelta per l accettazione dell ipotesi nulla, la probabilità di commettere l errore di rifiutare l ipotesi nulla quando in realtà è vera, è valida solamente per ogni singolo confronto. Se i confronti sono numerosi, la probabilità complessiva che almeno uno di essi si dimostri significativo solo per effetto del caso è maggiore [64]. L ANOVA permette il confronto simultaneo tra le medie, mantenendo invariata la probabilità α complessiva prefissata. Se in base all analisi della varianza si rifiuta l ipotesi nulla (identità delle medie), è interessante verificare tra quali medie la differenza sia significativa. Per effettuare confronti singoli è appropriato l utilizzo del test di Tukey o HSD (Honestly Significant Difference) test.

15 5.14 Software utilizzato Software utilizzato L analisi statistica dei dati è stata effettuata con il programma Origin- Lab OriginPro 7.5, mentre l elaborazione dei grafici è stata realizzata con il programma SigmaPlot 9.0. Per l estrapolazione dei dati relativi ai pesi molecolari delle proteine separate con i due metodi elettroforetici si è utilizzato il software ImageJ 1.36b. Le immagini sono state create o modificate con Adobe Photoshop CS2. Questa tesi è stata scritta e compilata con L A TEX 2ε.