Proteine: dove, quando e perchè. Milano, CusMiBio Settembre 2011

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1 Proteine: dove, quando e perchè Paolo Plevani Milano, CusMiBio Settembre 2011

2 Il dogma centrale della Biologia Molecolare DNA Trascrizione RNA Traduzione Proteina

3 Proteoma Proteome = Proteins encoded by the genome Il proteoma comprende tu9e le proteine espresse in una data cellula in un certo momento, incluse tu9e le isoforme della stessa proteina (splicing alterna=vo) e le loro modificazioni post- traduzionali. Mentre il genoma è costante per una data cellula ed iden=co per tu9e le cellule di un organismo (~ geni nell uomo), il numero di proteine prodo9e è molto piu elevato (un fa9ore ) in virtù del meccanismo, di splicing alterna=vo e delle modificazioni post- traduzionali. Inoltre, il proteoma è dinamico nel tempo e in risposta a fa9ori esterni, e differisce in maniera sostanziale tra i diversi =pi cellulari.

4 Proteine: dove, quando e perchè

5 Analisi di proteine: Tanti metodi: Elettroforesi e Western Blot

6 Elettroforesi su gel Metodo per separare macro- molecole (Proteine, DNA, RNA, etc.) sulla base delle loro proprieta chimico- fisiche quali: (1) dimensioni (2) forma (3) carica ele9rica

7 Elettroforesi di Proteine Piu complessa dell ele9roforesi di DNA Proteine diverse hanno cariche diverse Le proteine variano molto per forma (stru9ura) Generalmente il gel e fa9o di poliacrilammide

8 Perche usare Gel di Poliacrilammide per separare le proteine? I gel di poliacrilammide hanno una trama piu compa9a I pori hanno dimensioni minori che nei gel di agarosio Le proteine sono molto piu piccole del DNA Amminoacido medio = 110 Da Paio di nucleo=di medio = 649 Da 1 kilobase di DNA = 650 kda 1 kilobase di DNA codifica 333 amminoacidi = 36 kda

9 Ele9roforesi di proteine Condizioni Non Denaturan= Non- denaturante (na=vo): nessun pre- tra9amento delle proteine prima dell ele9roforesi Le proteine conservano la loro stru9ura 2 e 3 ; pon= disolfuro etc. Le proteine conservano la loro carica normale Le proteine sono separate sulla base di carica, dimensioni e forma Nome Carica Massa Forma Proteina Q Proteina R +3 30kD -4 42kD

10 Ele9roforesi di proteine in condizioni denaturan= Le proteine sono tra9ate con SDS (detergente anionico) prima dell ele9roforesi (SDS- PAGE) Le molecole di SDS si legano alle proteine Le proteine perdono la loro normale forma Le proteine hanno tu9e lo stesso rapporto carica/massa Le proteine vengono separate esclusivamente sulla base delle loro dimensioni Carica Massa +3 30kD SDS Carica Massa kD -4 42kD kD

11 SDS- Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS- PAGE) CH 3 CH 2 " SDS (Sodio Dodecil Solfato) Solubilizza e denatura le proteine Aggiunge cariche negative alle proteine CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 O O S O - O SDS

12 Proteina Nativa Carica netta: -4 Proteina trattata con SDS Carica netta: Molto (-)

13 Come funziona un Gel SDS- PAGE? Le proteine cariche nega=vamente si muovono verso l ele9rodo posi=vo s-s SDS, calore Proteine piu piccole si muovono piu velocemente Le proteine si separano per dimensione + Proteine con SDS

14 Estrazione delle proteine Lisi delle cellule con un tampone di lisi che dissocia le proteine e inibisce le proteasi cellulari Concentrazione dei sali Detergenti (Triton X-100, NP40, SDS) ph Inibitori di proteasi Bassa temperatura (ghiaccio) Proteasi Inibitori proteasi: Leupeptina, Pepstatina, Aprotinina, PMSF

15 Cosa c e nel tampone di caricamento? Un tampone (Tris) per fornire il giusto ph (6,8) SDS (Sodio Dodecil Solfato) per solubilizzare le proteine e fornire loro una carica nega=va complessiva Glicerolo per rendere pesan= i campioni e farli scendere nei pozzee Un agente riducente (DTT o β- Mercaptoetanolo) per rompere i legami disolfuro Un colorante (Blu di Bromofenolo) per visualizzare i campioni

16 SDS-PAGE Colorazione con Blu di Coomassie

17 SDS- PAGE: separazione di proteine in base al loro peso molecolare In presenza di SDS e di un riducente dei legami disolfuro, le diverse proteine vengono separate in elettroforesi su gel esclusivamente sulla base di differenze di peso molecolare delle loro catene polipeptidiche.

18 Come funziona: Il Gel Stacking gel: 4-5% gel superiore, ph % gel separatore, ph 8.8 Le molecole di acrilammide sono tenute assieme dalla bis- acrilammide, formando una stru9ura a laece Polimerizzazione piu rapida aggiungendo catalizzatori: TEMED e APS

19 Il Gel Componen= del gel SDS- PAGE Soluzione di Acrilammide/Bis- Acrilammide Tris- HCl ph 6.8 oppure Tris- HCl ph 8.8 SDS ddh2o TEMED APS (ammonio persolfato) Buffer di corsa (Tris, Glicina, SDS)

20 Come funziona: Proteine vengono caricate, viene applicata una corrente ele9rica Includere un marker di peso molecolare colorato 10-50ug di estra9o proteico totale 0.1-1ug di proteina purificata Ioni Cloruro (- ) / Proteina / Glicina (+) Stacking ph 6,8 Il Gel Si muovono verso il gel separartore ( resolving) Differenze di ph causano la ionizzazione della glicina, perme9endo alle proteine di migrare nel gel separatore Resolving ph 8,8 +

21 Il Gel % di acrilammide consigliata Dimensioni delle proteine 8% 10% 12% kda kda kda

22 Visualizzazione delle proteine nel gel I due metodi piu usati sono: Colorazione con il Coomassie Brilliant Colorazione con l argento Silver staining (puo essere visualizzato ~1ng di proteina per banda) Coomassie staining Silver staining

23 SDS- PAGE: determinazione del peso molecolare di una proteina

24 Stima dei pesi molecolari

25 Western Bloeng

26 Southern Blot: Per l analisi del DNA. (sonda = DNA o RNA). Northern Blot: Per l analisi dell RNA. (sonda = DNA o RNA). Western Blot: Per l analisi delle proteine. (sonda = anticorpo).

27 Cosa e un Western Blot? Una tecnica in cui le proteine sono separate mediante ele9roforesi su gel e successivamente trasferite su un supporto (membrana o filtro). Successivamente una specifica proteina viene iden=ficata mediante la sua reazione specifica con un an=corpo.

28 A cosa serve il Western Blot? Qual e la proteina che mi interessa? SDS- PAGE (non certo) Si basa sul confronto di peso molecolare Western blot (certo) Si basa su una reazione specifica an=gene- an=corpo +?

29 Fasi di un Western Blot Prima fase: ele,roforesi su gel. (Le proteine del campione vengono separate su un gel in base alle loro dimensioni) Seconda fase: trasferimento su membrana. (Le proteine nel gel sono poi trasferite su una membrana di nitrocellulosa mediante un campo ele9rico) Terza fase: saturazione o blocking. (La saturazione e usata per prevenire le interazioni non specifiche tra l an=corpo e la membrana)

30 Fasi di un Western Blot Quarta fase: legame dell an>corpo primario. (L an=corpo riconosce la proteina specifica immobilizzata sulla membrana) Quinta fase: legame dell an>corpo secondario. (L an=corpo secondario, coniugato a un enzima (AP o HRP), riconosce specificamente l an=corpo primario, gia legato alla proteina sulla membrana) Sesta fase: rivelazione o detec>on. (L enzima coniugato all an=corpo secondario scinde un substrato che, in corrispondenza della proteina specifica, sviluppa precipitato colorato o chemioluminescenza)

31 Western blot: seconda fase Immobilizzazione e trasferimento Le proteine nel gel sono ancora in soluzione Le bande diffondono e si confondono col tempo E necessaria l immobilizzazione per: Preservare in maniera permanente l esperimento di ele9roforesi Perme9ere il riconoscimento di proteine specifiche La strategia piu comune e il trasferimento su membrana Fa9a di Nitrocellulosa, PVDF (Polivinilidene fluoride) o nylon Si usa l ele9roforesi, in un processo de9o bloeng

32 Western blot: seconda fase Immobilizzazione e trasferimento Ele9robloeng Apparato di trasferimento Il gel e messo tra stra= di carta da filtro con la membrana a dire9o conta9o col gel sul lato verso l ele9rodo posi=vo Viene applicato un campo ele9rico e le proteine migrano fuori dal gel verso l ele9rodo posi=vo e si legano alla membrana Fa9o a 4 C per evitare surriscaldamento, decomposizione del tampone e degradazione delle proteine

33 Apparato per il trasferimento Semi-dry

34 Western Blotting Buffer-soaked filter papers Nitrocellulose membrane - + Gel Buffer SDS-PAGE Assemble sandwich Wet blotting Electrode Direction of transfer Graphite Electrode Plates - + Semi-dry blotting Nitrocellulose with bound proteins Stained (Red Ponceau)

35 Western blot: terza fase saturazione o blocking Per saturare i si= idrofobici liberi sulla membrana Per prevenire il legame dell an=corpo primario alla membrana stessa La9e scremato o Albumina di Siero Bovino (BSA)

36 Western blot: quarta fase incubazione con anticorpo primario

37 L an=corpo primario riconosce la proteina di interesse e non lega le altre proteine immobilizzate sulla membrana An=corpi come sonde: Molto sensibili Possono essere prodoe Immunizzando una specie diversa (an=corpi policlonali) Generando an=corpi monoclonali (mab) Economici

38 Anticorpi Ab + Ag Kd AbAg Kd = [Ab] = 10-9 M [AbAg]

39 An=corpi (immunoglobuline, Ig) Una proteina a forma di Y secreta nel sangue in risposta ad uno specifico an=gene, come un ba9erio o un virus, che neutralizza l an=gene legandosi specificamente ed esso e producendo una risposta immunitaria. An=corpi

40 An=corpi policlonali Produzione Immunizzazione ripetuta dell animale con l an=gene (pep=de, proteina purificata o ricombinante) Il sangue e prelevato nel momento di picco di produzione dell an=corpo ed e purificato il siero Il pool degli an=corpi riconosce mol= epitopi dell an=gene usato per l immunizzazione

41 An=corpi monoclonali Riconoscono solo un epitopo Fusioni tra linfoci= B (milza/ linfonodi) e cellule di mieloma di topo

42 Western blot: quinta fase Incubazione con anticorpo secondario

43 An=corpi An=corpo primario Riconosce la proteina An=corpo secondario Lega l an=corpo primario Generalmente prodo9o in una specie diversa Coniugato con un enzima Il substrato dell enzima sara conver=to in un prodo9o colorato Puo anche essere radioaevo o fluorescente

44 Western blot: sesta fase rivelazione o detection Fosfatasi alcalina (AP) o perossidasi del rafano (HRP: horseradish peroxidase) Conversione di un substrato colorimetrico in un precipitato colorato Substra= Chemioluminescen= Eme9ono luce se conver== dall enzima Possono essere visualizza= su lastre radiografiche Marcatura radioaeva An=corpi secondarii bio=nila=

45 Western blot substrato HRP HRP luce Anticorpo primario Anticorpo secondario Rivelazione Il substrato metabolizzato dalla perossidasi (HRP) emette luce pg proteina

46 Le proteine possono essere modificate dopo la loro sintesi: modificazioni post-traduzionali Fosforilazione Glicosilazione Ubiquitinazione etc. Tali modificazioni fanno variare il PM della proteina e, quindi, possono essere evidenziabili dopo elettroforesi e western blot

47 La risposta cellulare a danni al DNA Danni al DNA Checkpoints di risposta a danni Apoptosi Ciclo cellulare Replicazione DNA Trascrizione Riparazione e ricombinazione del DNA Molto conservati negli eucarioti: dal lievito all uomo Mutazioni nei geni dei checkpoints causano instabilità genomica e tumori

48 Il checkpoint innescato da danni al DNA è una via di trasduzione dei segnali Lievito Uomo Mec1, Tel1, Ddc2, Rad17, Mec3, Ddc1 Rad24,RFC Proteine sensori ATR, ATM, ATRIP, hrad1, hhus1, hrad9, hrad17, RFC Rad9, Rad53, Chk1 Trasduttori BRCA1?, CHK2, CHK1 RPA, Polα-primase, Cdc28, Swi6, Pds1, Cdc14,... Effettori RPA, p53, CDC25, CDK,...

49 DNA damage checkpoint in S. cerevisiae RFC Ddc2 Rad24 5 Ddc1 P P Mec1 P P P P RPA RPA RPA P P Ddc2 RPA RPA RPA Mec3 Rad9 P Rad9 P P P Rad53 P P Rad9 Rad9 Rad53 Targets Rad53 FOSFORILAZIONI!!!!!!