Modulo 3. Lavorare con le proteine

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1 Modulo 3 Lavorare con le proteine

2 La purificazione delle proteine Il primo passaggio nello studio delle proprietà di una proteina è la sua purificazione: la sua estrazione dalla matrice biologica in cui si trova. Le proteine si possono ottenere o dal sito di produzione endogena (i tessuti) o mediante tecniche ricombinanti. Lisi cellulare: per ottenere un estratto grezzo contenente la proteina di interesse è necessario lisare le cellule in un tampone. Metodo dipende dalla localizzazione cellulare della proteina di interesse. estratto grezzo Lisi: metodi chimici: solventi, detergenti + enzimi Metodi fisici: shock osmotico, omogenizzazione. Spesso è necessario inattivare enzimi che possono degradare le proteine (es. lavorando a freddo e aggiungendo alla sospensione inibitori per gli enzimi proteolitici). Omogenizzatore per cellule

3 Purificazione delle proteine L estratto grezzo viene centrifugato per rimuovere il materiale non risospeso nel tampone. Si eliminano altri tipi di macromolecole solubili (es. acidi nucleici) con enzimi specifici che li degradano (nucleasi) Si separano le proteine da altre piccole molecole tramite dialisi o ultrafiltrazione dialisi ultrafiltrazione Sezione del tubo di dialisi

4 Colonna Abs Separazione di proteine tramite cromatografia La separazione di macromolecole in una miscela dipende dalla loro interazione differenziale con una matrice immobile (fase stazionaria). Le molecole da separare sono disciolte in un eluente (fase mobile) che attraversa la fase stazionaria ad una velocità definita (ml/min) Le molecole che non interagiscono con la fase stazionaria escono con il fronte dell eluente. Quelle che interagiscono sono rallentate. Più forte è l interazione, più lento il tempo di transito. Campione Le proteine si separano in base alle loro caratteristiche chimico-fisiche: Tempo 1) Idrofobicità/polarità della superficie 2) Carica 3) Grandezza 4) Interazioni specifiche con ligandi Spettrofoto metro

5 Cromatografia per scambio ionico Fase stazionaria: matrice polimerica modificata con gruppi cationici (+) o anionici (-). Le molecole da separare si legano alla fase stazionaria mediante interazioni elettrostatiche. Fase mobile è acquosa con concentrazione crescente di sali o ph (gradiente) i polipeptidi si staccano in base alla crescente forza ionica o ph della fase mobile

6 Cromatografia ad esclusione molecolare (GPC) La fase stazionaria è un gel polisaccaridico legato ad un supporto inerte Le proteine si separano in base alla loro grandezza, dalla piu grande alla piu piccola. Le proteine più piccole entrano nei pori della matrice cromatografica e compiono un tragitto maggiore Quelle più grandi sono escluse dai pori e passano per gli interstizi fra le particelle della fase stazionaria, eluendo in un tempo inferiore granuli di polisaccaride polimerizzato Le molecole piccole entrano nei pori le molecole grandi restano negli interstizi Se utilizzate proteine a Mw noto (standards), si possono possono determinare i Mw dei campioni Ve= volume di eluizione Vo= volume di esclusione

7 Cromatografia a fase inversa (RP) Fase stazionaria organica, fase mobile H 2 0 solvente organico Peptidi/proteine si legano alla fase stazionaria mediante interazioni idrofobiche. Si staccano progressivamente in base all aumento di idrofobicità della fase mobile H 2 O H 2 O H 2 O H 2 O H 2 O H 2 O H 2 O H 2 O H 2 O CH H 2 O 3 CN CH 3 CN CH 3 CN H 2 O H 2 O CH 3 CN

8 Cromatografia ad affinità Interazione specifica tra la proteina ed un suo ligando (recettore) legato covalentemente ad un supporto (fase stazionaria) Il rilascio della proteina avviene per competizione con il ligando solubile o interferendo (variando) con le condizioni del legame. + GG GG + GG

9 Elettroforesi su gel Tecnica di separazione di proteine che sfrutta il movimento di una molecola carica in un campo elettrico La molecola si muove verso l elettrodo di segno opposto con una velocità (mobilità elettroforetica) che è proporzionale all entità del campo elettrico (E) e della sua carica (q) e inversamente proporzionale all attrito che incontra nel muoversi (f coefficiente frizionale) dovuto alla forma e alla dimensione della molecola oltre che dalla viscosità e dal tipo di supporto. v = Eq γ Se l elettroforesi avviene in un gel di supporto (poliacrilammide): c e un effetto setacciante influenza la mobilità della molecola La separazione in elettroforesi di una proteina può essere effettuata in base : Alla carica Alle dimensioni A entrambe poliacrilammide

10 Elettroforesi denaturante in SDS (SDS-PAGE PolyAcrilamide Gel Electrophoresis) Per fare in modo che le proteine si separino solo per un principio (dimensione) esse vengono fatte reagire con il detergente anionico denaturante SDS In questo modo tutte le proteine hanno lo stesso rapporto q/m e si separeranno solo in base al coefficiente frizionale f (relativo alla massa) proteina in forma nativa + SDS Apparecchiatura per elettroforesi verticale proteina denaturata incapsulata da Molecole di SDS

11 SDS-PAGE separazione delle proteine In SDS-PAGE la mobilità delle proteine nel gel è proporzionale alla loro dimensione (MW). Con l utilizzo di marker proteici di dimensione nota è possibile stimare la massa di una proteina. La separazione indica numero e abbondanza delle proteine del campione (grado di purezza). Permette di stimare l abbondanza proteica relativa (intensità della banda) Visualizzazione delle proteine Colorazione con blue di Coomassie

12 Visualizzazione delle bande proteiche Proteine di massa nota SDS-PAGE, la mobilità delle proteine è inversamente proporzionale alla alla loro grandezza (Mr) La separazione consente di ottenere informazioni su grado di purezza e quantità Stima della massa della proteina

13 Analisi delle proteine totali (proteoma) del batterio E. coli tramite elettroforesi bidimensionale alto Mw SDS - PAGE basso

14 Western blot ll Western blot io immunofissazione è una tecnica biochimica che permette di identificare una determinata proteina in una miscela di proteine, mediante il riconoscimento da parte di anticorpi specifici; La procedura può essere suddivisa in 3 passaggi: 1. separazione elettroforetica dei polipeptidi 2. trasferimento di tutte le proteine su una membrana appropriata 3. visualizzazione di specifiche proteine di interesse

15 Determinazione della concentrazione proteica METODI diretti I - assorbimento del legame peptidico ( =214 nm,) - assorbimento della tirosina ( =280 nm) - assorbimento del triptofano ( =280 nm, ) METODI indiretti (colorimetrici) - acido bicinconinico (legami peptidici) - blue di coumassie Valore assorbito A (assorbanza) è direttamente proporzionale alla concentrazione della proteina 0.4 A 0.2 proteina standard M concentrazione

16 Metodo diretto: misura dell assorbanza Sfrutta le proprietà dei legami e gruppi chimici che assorbono la luce nella regione dell UV. λ = 280 nm Il legame peptidico (210 nm) λ = 276 nm λ = 256 nm (debole) Dipende dalla composizione aa e dalla struttura della proteina

17 Spettrometria di massa Consente l identificazione e la analisi quantitativa di una molecola dalla determinazione della sua massa. Il principio si basa su fenomeni correlati alla massa e alla carica: A) la traiettoria di uno ione o particella carica in movimento viene modificata per l azione di un campo magnetico o elettrico, l entità della deviazione è funzione del rapporto m/c della particella. B: ioni o particelle cariche, accelerati da un campo elettrico assumono velocità in dipendenza dalle loro masse.

18 Spettrometria di massa mediante elettrospray (ESI MS) (Electrospray ionization mass spectrometry) Permette di calcolare la massa di una molecola polare, labile e non volatile. La soluzione proteica è dispersa sotto forma di piccolissime gocce e forzata attraverso un capillare sotto alto voltaggio (spray) (a) Il solvente evapora e gli ioni (multicarica) in fase gassosa che si generano entrano nello spettrometro di massa nel vuoto. Gli ioni vengono separati da un campo magnetico nel tempo o nello spazio in funzione della loro m/z. Lo spettro generato (b) è costituito da una serie di picchi ogni picco da sin a dx corrisponde ad una certa m con z+1 La massa della proteina viene calcolata utilizzando i picchi di diversa m/z

19 Spettro di massa della mioglobina

20 Spettroscopia MALDI MS Permette di ottenere la sequenza di residui aa. Si basa sull uso di un doppio mass spettrometro (MS tandem o MS/MS) Proteina viene tagliata in piu peptidi la miscela è iniettata nel MS-1 Viene selezionato un peptide che nella camera di collisione viene frammentato I frammenti generati entrano nel MS-2 dove sono analizzati per m/z per l identificazione della sequenza Tipico spettro (b) con picchi