CROMATOGRAFIA. Separazione: principio di ripartizione tra due fasi, FASE MOBILE e fase fissa, FASE STAZIONARIA.

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1 CROMATOGRAFIA Cromatografia: insieme di tecniche che consentono di separare composti chimici, componenti in campioni complessi e miscele, ai fini di un analisi sia qualitativa che quantitativa. Cenni storici: nasce nel 900, grazie al botanico di origine russa M. Tswett che coniò il termine cromatografia, dal greco kroma : colore, graphein : scrivere. Alla lettera: scrittura del colore. Riuscì infatti a separare i pigmenti fogliari mediante una colonna di vetro impaccata con una matrice solida. campione Separazione: principio di ripartizione tra due fasi, FASE MOBILE e fase fissa, FASE STAZIONARIA. t 1 t 2 t 3 Sistema di rivelazione Ripartizione differenziale tra fase mobile e fase stazionaria : K (r) = Cs/Cm L evoluzione di questa tecnologia, basata su uno schema alla base semplicissimo, ha dato origine a metodiche altamente diversificate e versatili per consentire la separazione ottimale di composti specifici o gruppi di composti, con caratteristiche chimiche vicine, contenuti nei campioni da analizzare.

2 CROMATOGRAFIA E CHIMICA CLINICA Separare/identificare/quantificare molecole di varia natura e origine in campioni biologici, fluidi corporei o cellule, estratti di plasma, siero e tissutali - miscele molto complesse Molecole a basso PM: ~ 1500 Da: endogene: neurotrasmettitori, ormoni, metaboliti; ex.: catecolamine(noradrenalina, dopamina, etc..); ormoni steroidei (ex. neurosteroidi) ; metaboliti (ex. amino acidi, basi azotate e nucleotidi, colesterolo); peptidi; ex.: neuropeptidi (vasopressina, ossitocina, etc..); glutatione (tripeptidi).. esogene: farmaci, sostanze tossiche, inquinanti organici, nutrienti, ex: antidepressivi, antitumorali monitoraggio terapeutico; pesticidi, ftalati tossicologia; vitamine, luteina monitoraggio stato nutrizionale. Molecole a moderato PM: ~ 2000 PM 5000 Da endogene: peptidi antimicrobici difese innate (ex. defensine); peptidi intestinali e dell appetito (NPY, etc..) ; polisaccaridi a medio PM; lipidi esogene: peptidi microbici o di origine infettiva microbiologia ; beta-glucani - nutrizione Molecole ad alto PM: > 5000 Da endogene: macromolecole, proteine, acidi nucleici, zuccheri in fluidi corporei e tessuti etc.. - ricerca clinica esogene: macromolecole di origine esogena ricerca clinica

3 Classificazione della CROMATOGRAFIA: in base alla forma del supporto cromatografico che contiene la fase stazionaria e in base allo stato fisico della fase mobile Supporto cromatografico fase stazionaria: Cromatografia planare: su strato sottile, su gel o su carta (Thin-Layer Chromatography, TLC; Paper Chromatography); Cromatografia su colonna: colonna contenente la fase stazionaria, una matrice di varia natura in base al tipo di cromatografia Cromatografia su colonna - stato fisico fase mobile: Cromatografia Liquida (Liquid Chromatography, LC) Gas cromatografia (Gas Chromatography, GC) Cromatografia Supercritica (Supercritical Fluid Chromatography, SFC)

4 Peso molecolare (Da) Distinzione in base al meccanismo di separazione : -Adsorbimento - ripartizione Siti attivi sulla fase stazionaria, trattenimento selettivo delle molecole da separare nel campione o nella miscela. Idrofobicità-polarità delle molecole da separare, della fase mobile e della fase stazionaria. Fase normale fase inversa. -Scambio ionico Presenza di cariche sulla fase stazionaria e competizione tra molecole ioniche del campione da separare e della fase mobile. Forze elettrostatiche resine a scambio ionico/cationico e anionico. -Esclusione Gel filtrazione, permeazione. Matrice inerte. Separazione in base al peso molecolare. -Affinità fase stazionaria inerte coniugata con molecoleligandi che legano in modo specifico le molecole da separare. Ex.: Reazione Antigene- anticorpo. Separazione e purificazione di macromolecole biologiche. Cromatografia Liquida su colonna : classificazione Idrofobici Apolari adsorbimento Idrofilici Polari non ionici fase inversa C4-C18 gel permeazione Polarità ripartizione esclusione affinità Ionici scambio ionico fase normale gel filtrazione Applicazioni prevalenti in base al PM e polarità o carica degli analiti da separare Cromatografia preparativa ; cromatografia analitica

5 CROMATOGRAFIA SU COLONNA a pressione atm Raccolta di frazioni, rivelatore Lavorando a pressioni molto più elevate della pressione atmosferica, ex psi, ha migliorato la prestazione della cromatografia e la quantificazione di molte sostanze in tempi molto più brevi. HPLC

6 Signal IL CROMATOGRAMMA E IL PICCO ANALITICO Caratteristiche salienti del picco analitico T M Fs T R T R Linea di base W b Ap W H H H/ Time, min Ap= Apice del picco; H= Altezza del picco, distanza tra la linea di base e A; H/2: metà altezza del picco; segnale del rivelatore W 1/2 : Ampiezza del picco (min), presa a H/2; W b : Ampiezza alla base del picco (min), presa alle tangenti dei punti di flesso alla base dl picco. Caratteristiche del cromatogramma: Fs = Fronte del solvente; T M : o t 0, definizione: tempo morto o tempo necessario affinché una molecola non trattenuta dalla fase stazionaria attraversi V 0 = volume morto della colonna; T R : tempo di ritenzione della sostanza (analita): T M + T R = T R, dove T R = distanza tra Fs e punto intersezione della perpendicolare da Ap sulla linea di base.

7 BASI TEORICHE: equazioni che definiscono le caratteristiche di ELUIZIONE, RISOLUZIONE e SIMMETRIA dei picchi degli analiti. CARATTERISTICHE DI ELUIZIONE E RISOLUZIONE Fattore di capacità: K = (V V 0 /V 0 ) oppure (t-t 0 /t 0 ), dato dal grado di ripartizione tra fase stazionaria e fase mobile Efficienza della colonna analitica: Piatto teorico: sezione di colonna che è in grado di creare un equilibrio di ripartizione tra le due fasi degli analiti. Ampiezza del picco W b e T R : N= 16 (T R /W b ), dove N= numero di piatti teorici, espresso anche come altezza del piatto teorico H = L/N, con L = lunghezza della colonna (cm); da cui: N= L/H N eff = 16 (T R /W b ) 2, formula del numero di piatti teorici effettivi. Formula considerando W 1/2 N eff = 5.55 (W 1/2 / T R ) 2 Altezza di un piatto teorico effettivo: H = L/N eff o L/16 (W b /T R ) 2 più è piccola, più i picchi sono stretti e meglio risolti. Equazione che definisce i piatti teorici in funzione dei tempi di rit.

8 Equazione di Van Deemter (LC/HPLC): allargamento del picco H= A/(1 + C m /u 1/2 ) + B/u + C s u + C m u 1/2 H = altezza piatto teorico ed efficienza colonna; più H è un valore basso tanto più l efficienza della colonna è elevata u= velocità lineare della fase mobile; A, B e C: fattori che concorrono all allargamento del picco e alla diminuzione dei piatti teorici; A = Diffusione di Eddy o diffusione erratica : delle molecole trasportate nella fase mobile; queste possono seguire percorsi diversi, ex. lineari o tortuosi; B= Diffusione longitudinale; dispersione delle molecole rispetto al flusso della fase mobile; a bassi flussi ha un peso nell equazione: B/u; Cs, Cm = Diffusione data dall affinità differenziale di una molecola per la fase mobile o per la fase stazionaria; effetto maggiore quanto più è veloce il flusso della fase mobile: Csu e Cmu 1/2, specie per Csu. Cs= d 2 spessore/ds; Cm= d 2 impaccamento/dm B/u Csu

9 H H/2 Risoluzione dei picchi e selettività: Risoluzione = (Δtr/W m ) = Δtr/W m 1/2 1.5 min CARATTERISTICHE DI SIMMETRIA Fattore di asimmetria - Tailing factor: min fronting Picchi simmetrici Fattore di asimmetria TF = AB/2AC 1.0 5%H. A. C. B tailing min

10 High Performance/Pressure - Liquid Chromatography cromatografia liquida ad alta prestazione/pressione HPLC Column colonne U(H)PLC Nano-HPLC Principali tipi di rivelatore: Waste Potenziamento tecnologico del sistema Colonne analitiche con caratteristiche chimico-fisiche peculiari Colonne analitiche e sistemi U(H)PLC e nano-hplc: Rivelatori ad alte prestazioni Alta velocità, alta produzione, alta risoluzione analitica

11 HPLC: SISTEMA MODULARE Bottiglie con eluenti Degasatore Termostato colonne Pre-colonna in linea Pompa Miscelazione ad alta e bassa pressione Analisi isocratica Analisi in gradiente (eluizione binaria, etc.) Cromatografia di ripartizione in fase normale o inversa: Colonne analitiche: Siringa HPLC Valvola d iniezione RP-LC: Reversed-phase Liquid Chromatography U(H)PLC: ultra performance HPLC Colonna analitica per nano-hplc

12 RIVELATORI Ultravioletto (UV), UV-PDA, Fluorimetro, detector elettrochimico, Spettrometro di Massa UV-PDA Fluorimetro Elettrochimico HPLC con spettrometro di massa Hyphenated HPLC: più rivelatori in serie

13 TECNICHE ESTRATTIVE: Alta influenza sulla riuscita dell analisi cromatografica Matrici biologiche complesse: ex. urine, siero/plasma, saliva, ago aspirato, cellule Devono essere pulite il più possibile da contaminanti e interferenti analitici. Per separare e quantificare piccole molecole - Deproteinizzazione: precipitazione preliminare acida, TFA, TCA, H 2 SO 4, HClO 4 Estrazione in fase solida: cartucce contenenti materiale solido di varia natura, cartucce estrattive con caratteristiche vicine a quelle della colonna analitica (ex. C18) cartucce a ritenzione per sostanze più o meno polari, resine a scambio ionico. Estrazione in fase organica: Fase acquosa (campione) e fase organica solvente estrattivo. Anche su colonna. Solventi: Acetonitrile, Metanolo, n-esano/eptano o miscele di questi, in condizioni acide o base Potenziamento delle tecniche estrattive Estrazione in fase liquida e solida ottimizzate fase solida Workstations- automatizzazione Uso di standard(s) interno/i (SI): (Area o Altezza) analita /(Area o Altezza ) SI

14 Tecniche di preparazione del campione per biopolimeri e macromolecole- Proteine Tecniche di ultrafiltrazione Tecniche di precipitazione frazionata salting out: solubilità delle proteine o al punto isoelettrico Tecniche elettroforetiche

15 COME SI LAVORA: -Matrice biologica: a) extracelllulare: sangue, urine, plasma, siero, liquor, liquido sinoviale, liquido amniotico, mezzi di coltura,etc.. ; b) intracellulare: tessuti, colture cellulari, omogenati etc.. -Estrazione degli analiti dalla matrice: preparazione del campione da iniettare per l analisi eliminare interferenze, pulire il cromatogramma da composti interferenti; procedura che deve garantire: integrità analita/i, giusta concentrazione finale nella soluzione d iniezione (in genere fase mobile) se si sceglie di lavorare con SI, aggiunta alla matrice prima o dopo l estrazione di solito conviene prima -HPLC dell estratto : iniezione del campione estratto e analisi cromatografica con il metodo preliminarmente messo a punto per l analisi dell analita/i. Scelta di: colonna, fase mobile, rivelatore e condizioni cromatografiche (flusso/pressione, temperatura), modalità isocratica o in gradiente. Interpretazione del cromatogramma; analisi dei picchi; confronto con gli standards.

16 Analisi qualitatitiva: identificazione del picco - si possono ottenere informazioni sull identità del picco cromatografico sia dal tempo di ritenzione che dalle caratteristiche del rivelatore. Riconoscimento in base al tempo di ritenzione: uso di standards; confronto tra i tr dei picchi dello standards e quelli del campione; Riconoscimento mediante il detector: ex. Il detector UV-fotodiodi (PDA o DAD) fornisce l analisi spettrale UV confronto tra spettro UV del picco dello standard e spettro del picco nel cromatogramma allo stesso tempo di ritenzione. Visualizza sostanze che assorbono in UV. Uso di doppio detector in linea: ex. Fluorimetrico ed elettrochimico; Detector in spettrometria di massa. Analisi quantitativa: una volta identificato il picco o i picchi d interesse si può procedere all analisi quantitativa. Il picco analitico può essere quantificato o misurandone l altezza H oppure integrandone l area A. Se si usa lo standard interno (SI), si deve utilizzare anche l H o l A dello SI. Rette di calibrazione: utilizzando gli STDs dell analita: iniezione di concentrazioni crescenti dello standards aggiunte nella matrice biologica, es. plasma; estrazione e cromatografia. Rette di calibrazione con lo SI: si procede come sopra ma si aggiunge ad ogni punto di concentrazione una concentrazione fissa di SI; estrazione e cromatografia. C= A a x + b o C = H a x + b C= (A a /A SI ) x + b o C= (H a /H SI )x + b

17 ESERCITAZIONE: HPLC Cromatografia ad esclusione molecolare con rivelazione fluorimetrica: separazione di proteine da estratto di saliva umana Size exclusion chromatography Gel permeation chromatography (GPC) Gel filtration Chromatography (GFC)

18 Prelievo di saliva Trattamento del campione, tecniche di estrazione come altre matrici biologiche. Fluidificazione. Elettroforesi di proteine e separazione di frazioni specifiche. Frazioni raccolte, derivatizzate con molecola fluorescente e iniettate come segue Condizioni cromatografiche: corsa isocratica, flusso 0.5 ml min -1,,temperatura: 25 C; colonna Zenix Sec100 (300 mm x 7.8 mm, 3 mm dpi); precolonna Zenix ; Detector fluorescenza: λ ex: 496 nm λ em : 518 nm. Composizione fase mobile: 97% soluzione NaH 2 PO mm, NaCl 200 mm, ph=7; 3% ACN (acetonitrile) 97:3 (v:v) fase acquosa:fase organica.