TECNOLOGIE BIOMOLECOLARI

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1 TECNOLOGIE BIOMOLECOLARI Purificazione di DNA da cellule vive Rif. Brown: cap. 3 T. A. Brown, BIOTECNOLOGIE MOLECOLARI, Zanichelli editore S.p.A Copyright 2007

2 Trattamento dei campioni biologici per l analisi degli acidi nucleici

3 Fase pre-analitica La rigorosa applicazione delle corrette modalità di prelievo, trasporto, trattamento e conservazione del campione è condizione preliminare ed essenziale per garantire l attendibilità dei risultati ottenuti con le tecniche di biologia molecolare. Percorso pre-analitico del campione - prelievo - conservazione (temperatura, tempo) - trasporto - trattamento del campione (estrazione acidi nucleici) - conservazione acidi nucleici 3

4 Errore pre-analitico Errore introdotto: - contaminazione crociata (falsi positivi) - frammentazione DNA per errata manipolazione Errore non eliminato: - inibitori della reazione di amplificazione 4

5 Prevenzione contaminazione (1/2) Suddivisione fisica aree di lavoro 1. Area di preparazione del campione (isolamento cellule, estrazione a. nucleici) 2. Area di preparazione della reazione della PCR (preparazione soluzioni, aliquote, mix reazione) 3. Area di amplificazione e analisi degli amplificati (PCR, EF, tecniche ibridazione, sequenziamento) Comportamenti operatore - muoversi secondo il flusso area1--->area2--->area3 - mai entrare nell area 1 o 2 con prodotti amplificati - lavorare con i guanti (che vanno cambiati quando si cambia area) 5

6 Prevenzione contaminazione (2/2) Organizzazione del lavoro - distribuzione materiale in funzione del tipo di lavoro (pipette, puntali, accessori differenti per ogni area) - strumentazione dedicata per ogni area - vetreria sterilizzata, materiale usa e getta - puntali con filtro (contaminazione canale pipette con aerosol contenenti a. nucleici) - soluzioni suddivise in piccole aliquote - pulizia superfici lavoro e apparecchiature con soluzioni decontaminanti (ipoclorito 2%) 6

7 Frammentazione del DNA Danneggiamento a causa sollecitazioni meccaniche - maneggiare con delicatezza - no vortex a velocità elevata - no pipettamento eccessivo e vigoroso Digestione da parte di nucleasi cellulari - lavorare con i guanti - soluzioni e materiali sterili - soluzioni contenenti EDTA Azione metalli pesanti (rottura legami fosfodiesterici) - soluzioni contenenti EDTA 7

8 Inibitori della reazione della PCR In quasi tutti i campioni biologi sono presenti sostanze con azione inibitoria sulla PCR che devono essere eliminate nella fase di preparazione del campione. Hb e suoi prodotti di degradazione Metalli pesanti (Fe ++ ) Proteine Lactoferrina Complessi polisaccaridici Eparina 8

9 TIPO DI CAMPIONE Sangue (leucociti) Tessuti (biopsie, in paraffina, villi coriali) Liquido di lavaggio broncoalveolare (BAL) Liquidi biologici: - urina - liquor - saliva - liquido amniotico - liquidi cavitari Bulbo di capello 9

10 Fase di preparazione del campione Scopo: ottenere materiale in condizioni ottimali per indagini di tipo molecolare Requisiti: - Non danneggiare: non introdurre errori - Rilasciare ac. nucleici - Concentrare: ottenere una quantità adeguata di a. nucleici - Eliminare inibitori PCR - Stabilizzare: tempo, temperatura, luce deteriorano 10

11 Separazione dei leucociti da sangue (buffy coat) - Sangue in EDTA (5 ml) - Centrifugazione (1000 g, 10 min, temp ambiente) - Prelievo buffy coat - Lisi RBC (1 ml ammonio cloruro, K bicarbonato, EDTA, ph 7.4) - Centrifugazione, scartare il surnatante - Lavaggi con PBS - Pellet di leucociti - Conservare a -20 C 11

12 Separazione dei linfociti da sangue Centrifugazione in gradiente di densità di FICOLL - Diluizione sangue (1:2 con PBS) - Stratificazione sangue su FICOLL (d=1.077 g/ml) - Centrifugazione (1000 g, min, 20 C) - 4 strati: - plasma - anello di linfociti - FICOLL - RBC sul fondo - Raccolta linfociti - Lavaggi, conservare a 20 C 12

13 Preparazione altri tipi di campione Urina, liquidi cavitari: - centrifugazione (separazione componente cellulare e frazione liquida) Liquor: - concentrazione (molecole PM>100 dalton) Campioni delle vie respiratorie (BAL, espettorato): - fluidificazione con enzimi mucolitici - concentrazione delle cellule (centrifugazione) Campioni da biopsie: - disgregazione tessuto (bisturi, omogenizzatore) - eventuale lisi RBC presenti 13

14 Conservazione campioni Per estrazione DNA - Sangue: +4 C (24-48 ore) -20 C (anni) - Leucociti: -20 C - Pellet: -20 C - Liquor : +4 C trattato: -20 C - Tessuti: N 2 liquido Per estrazione RNA - Tutti i campioni a -80 C 14

15 Estrazione del DNA: fasi 1. Lisi cellulare ed inativazione delle nucleasi 2. Purificazione del DNA 3. Precipitazione DNA 4. Valutazione quantitativa DNA estratto 5. Conservazione 15

16 1. Lisi cellulare Lo scopo di questa fase è di liberare il DNA dai nuclei e dalle proteine istoniche ed inoltre di inattivare le proteasi - Disgregazione meccanica: - lisi ipotonica - omogenizzazione - Trattamento con agenti chimici: - detergenti (SDS, Sarcosyl, Nonidet P40) - agenti caotropici (urea, ioduro di sodio, guanidina tiocianato) - Digestione enzimatica: - proteinasi K 16

17 2. Purificazione DNA Lo scopo di questa fase è la separazione del DNA dalle componenti cellulari (proteine, lipidi, polisaccaridi) e sostanze interferenti - Utilizzo di solventi organici Fenolo (denatura le proteine) Cloroformio (solubilizza i lipidi) Isobutanolo - Metodo del salting out Utilizza alte concentrazioni saline per rimuovere le proteine (NaCl 6M) - Cromatografia A scambio anionico (matrice carica positivamente) Per adsorbimento (matrice di silice) 17

18 3. Precipitazione DNA Lo scopo di questa fase è di concentrare, desalificare e recuperare il DNA in forma solida permettendone il successivo ridiscioglimento nella soluzione desiderata - Trattamento con alcooli - etanolo: in presenza di alte concentrazioni di sali monovalenti (sodio acetato, ammonio acetato) - isopropanolo: non richiede alte concentrazioni saline ma è meno facilmente eliminabile dell etanolo 18

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