Cristallizzazione del lisozima

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1 Laboratorio di Metodologie Biomolecolari Modulo di Biologia Molecolare Claudia Binda Cristallizzazione del lisozima

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3 La funzione delle proteine è strettamente correlata alla loro struttura tridimensionale Risolvere (cioé scoprire) la struttura di una macromolecola per studiarne la funzione e i meccanismi molecolari alla base dei processi biologici in cui essa è coinvolta

4 Conoscere la struttura permette di progettare un farmaco ( drug design ) Molti farmaci agiscono legandosi ad un target proteico (per es. un enzima) e alterandone l attività Il sito di legame è in genere formato da una cavità o una tasca Meccanismo di legame lock-and-key

5 In generale, determinare la struttura di una molecola significa conoscere la disposizione spaziale di ogni atomo rispetto all altro

6 Prima Costruire un MODELLO che rappresenta la posizione degli amminoacidi ( atomi) l uno rispetto all altro

7 e oggi un MODELLO computer-grafico generato da programmi che convertono in una figura 3D un file in cui ad ogni atomo è associata una coordinata xyz ma a volte è ancora utile il modellino! (stampa 3D)

8 The.pdb file

9 Rappresentazione grafica di una struttura 3D di una macromolecola biologica

10 (Bio)cristallografia a raggi X

11 Vedere gli oggetti mm µm i nostri occhi utilizzano la luce (parte del visibile dello spettro elettromagnetico)

12 attraverso le lenti del microscopio ottico nel caso di microbi o cellule

13 Vedere gli oggetti nm Å 1 Å = 0.1 nm = 10-7 mm = m

14 Cristallografia a raggi X il campione da esaminare (la molecola) deve essere in forma cristallina

15 Un cristallo è un solido in cui le molecole sono disposte in modo ordinato (periodico) lungo le tre dimensioni

16 campione (cristallo di macromolecola) diffraction pattern raggi X calcolo della mappa della densità elettronica

17 Come si cristallizza una macromolecola? Crystallization Solubilization

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19 Diagramma di fase di una proteina Salt

20 Agenti precipitanti per la cristallizzazione di macromolecole: SALI: ammonio solfato, sodio cloruro ecc. POLIMERI: polyethylene glycol (PEG).

21 L enzima lisozima Enzima di 15 kda Attività battericida (lisi della parete batterica) Descritto da Fleming nel 1922 Struttura nel 1965 (prima struttura di un enzima)

22 Fare le diluizioni Esempio: Preparare 100 ml di una soluzione 3 M del reagente X partendo da una soluzione stock 5 M C 1 x V 1 = C 2 x V 2 C 1 = concentrazione di partenza (= stock a disposizione) V 1 = volume dello stock a disposizione da cui partire C 2 = concentrazione finale V 2 = volume finale 5 x V 1 = 3 x 100 V 1 = 60 ml Prendere 60 ml di soluzione stock 5 M e aggiungere 40 ml di solvente (es. acqua)

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24 tipo di precipitante concentrazione di precipitante concentrazione proteina ph (vari tamponi) additivi temperatura tecniche di cristallizzazione

25 Fattori importanti nella cristallizzazione di una macromolecola: purezza omogeneità stabilità regioni disordinate

26 Automatizzazione: il robot per cristallizzare

27 Buone regole per il lavoro sperimentale in laboratorio: attività in gruppo, attività in singolo (lavorare in team) scrivere sul quaderno (riproducibilità dei risultati) e sulle provette utilizzo del waste (normale e Alipak) utilizzo delle pipette

28 Utilizzo delle pipette automatiche 1. Maneggiare con cura (pericolo di scalibrazione) 2. Impostare il volume N.B.: quando il volume viene portato da un valore superiore a uno inferiore, è sufficiente ridurre l impostazione fino a ottenere il volume desiderato. Per aumentare l impostazione del volume, ruotare la manopola di selezione portandola leggermente al di sopra del volume desiderato, quindi ruotarla lentamente fino al valore corretto. Questa operazione eviterà errori di trascinamento.

29 Utilizzo delle pipette automatiche 3. Immergere il puntale Volume pipetta Profondità di immersione 2 e 10ul 1mm 20 e 100ul 2-3mm 200 e 1000ul 3-6mm 5000ul e 10ML 6-10mm 4. Riempire il puntale Sebbene i puntali possano avere un intervallo (nominale) consigliato del 10%-100% del volume massimo (volume nominale), la precisione migliore può essere raggiunta con un intervallo più limitato e ottimizzato, pari al 35%-100%. Premere e rilasciare lo stantuffo in modo lento e graduale

30 Interpretare i risultati: osservazione delle gocce di cristallizzazione al microscopio clear drop

31 Interpretare i risultati: osservazione delle gocce di cristallizzazione al microscopio brown amorphous precipitate light precipitate

32 Interpretare i risultati: osservazione delle gocce di cristallizzazione al microscopio crystal grown from amorphous precipitate spherulites crystalline precipitate skin (denatured protein)

33 Interpretare i risultati: osservazione delle gocce di cristallizzazione al microscopio plates «sea urchin» needles crystal