L USO DEL MICROSCOPIO OTTICO

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1 L USO DEL MICROSCOPIO OTTICO

2 Visualizzazione dei microrganismi La visualizzazione dei microrganismi richiede l uso del microscopio ottico o del microscopio elettronico. Il microscopio ottico composto in campo chiaro permette l osservazione di un immagine scura su uno sfondo luminoso, grazie alle differenze di contrasto (capacità delle cellule di assorbire o disperdere la luce) esistenti fra gli stessi e il mezzo circostante. Esistono diversi tipi di microscopi ottici: in campo chiaro, a contrasto di fase, in campo oscuro e ad interferenza. Microscopio ottico in campo chiaro

3 Microscopio ottico composto La parte meccanica del microscopio ottico è costituita dallo stativo formato da una base pesante ed un braccio. Nel braccio sono inserite le manopole per la messa a fuoco grossolana (macrometrica) e di precisione (micrometrica). Il tavolino sorregge i vetrini da esaminare che sono bloccati mediante dei fermi e porta montato al di sotto il sistema di lenti del condensatore. Le parti meccaniche fondamentali del microscopio ottico composto.

4 Microscopio ottico composto La base porta la sorgente luminosa La luce attraversa le varie lenti del microscopio (condensatore, obiettivo e oculare) fino a raggiungere l occhio. Un sistema di lenti convergenti, detto obiettivo, ingrandisce l oggetto, la cui immagine viene ulteriormente ingrandita da un secondo sistema di lenti, detta oculare. CONDENSATORE Il percorso della luce in un microscopio ottico.

5 Il CONDENSATORE Condensatore: sistema di lenti che inviano all obiettivo la luce. Il condensatore è provvisto di un diaframma ad iride (di apertura) che regola l ampiezza del cono di luce che entra nell obiettivo. Condensatore con diaframma ad iride.

6 Gli obiettivi Obiettivi che sono sistemi di lenti convergenti che danno la prima immagine ingrandita del campione. Sono avvitati su un portaobiettivo a revolver che ne porta fino a sei a diverso ingrandimento. Sistema di lenti dell obiettivo. Il valore dell ingrandimento (da 20x, 40x, 60x e 100x) è inciso sulla montatura come lo spessore dei vetrini coprioggetto (0,17 mm). Sono indicati i valori dell apertura numerica dei diversi obiettivi. Obiettivi montati su un portaobiettivi a revolver.

7 Gli obiettivi

8 GLI OCULARI L oculare può essere unico oppure doppio. L oculare porta inciso un numero sulla montatura che indica il suo potere di ingrandimento (10x, 15x). Questo valore, moltiplicato per l ingrandimento dell obiettivo, dà l ingrandimento totale del microscopio nell osservazione visiva. Oculare con inciso sulla montatura il proprio ingrandimento.

9 Ingrandimento del microscopio L ingrandimento totale di un microscopio ottico nell osservazione visiva, è dato dal prodotto dell ingrandimento proprio dell obiettivo e quello dell oculare. Il microscopio ottico composto permette di ottenere un ingrandimento utile massimo di circa X (volte). La massima risoluzione di un microscopio ottico è 0,2 µm. Un ingrandimento superiore fornice un immagine sfuocata per via della proprietà fisica nota come risoluzione o potere di risoluzione. Calcolo dell ingrandimento totale di un microscopio ottico.

10 Ingrandimento dell immagine Il microscopio ottico utilizza il sistema di lenti dell obiettivo per indirizzare e focalizzare i raggi luminosi in modo da produrre un immagine ingrandita di oggetti molto piccoli. L occhio umano può essere considerato un microscopio semplice. l immagine di un oggetto (Ob) formata sulla retina, è più piccola quando questo è lontano dall occhio (Im 1 ) rispetto a quando lo stesso oggetto è più vicino (Im 2 ). Microscopio semplice: ingrandimento dell immagine nell occhio umano.

11 Ingrandimento dell immagine L osservatore mette a fuoco l oggetto regolando la distanza dalla lente dell oculare e da quella dell obiettivo fino a che non si forma un immagine nitida. Nel diaframma oculare del microscopio si forma un immagine reale ingrandita e capovolta rispetto all oggetto. L occhio percepisce un immagine virtuale ingrandita e dritta rispetto all oggetto. Immagine reale Formazione dell immagine nel microscopio ottico composto

12 Ingrandimento dell immagine Immagine virtuale ingrandita e dritta rispetto all oggetto Immagine reale ingrandita e capovolta Formazione dell immagine nel microscopio ottico composto.

13 IL POTERE DI RISOLUZIONE La massima risoluzione di un microscopio ottico è 0,2 µm. Due oggetti che si trovano ad una distanza inferiore l uno dall altro non possono essere osservati distintamente ma appaiono come oggetto unico o come dischi sovrapposti. D < 0,2 µm D < 0,2 µm D > 0,2 µm

14 IL POTERE DI RISOLUZIONE Il potere di risoluzione del microscopio ottico è la distanza minima (d) che deve intercorrere tra due punti dell oggetto per poterli distinguere come separati. Il potere di risoluzione (d) è funzione della lunghezza d onda della luce utilizzata (λ) e di una proprietà caratteristica dell obiettivo conosciuta come apertura numerica (n sen θ). L apertura numerica (n sen θ) = prodotto dall indice di rifrazione (n) del mezzo interposto fra il preparato e la lente frontale dell obiettivo e l apertura angolare (θ), che rappresenta l ampiezza angolare del cono di raggi di luce raccolti dalla lente dell obiettivo e provenienti dal campione. Lente obiettivo Sen θ oggetto Sorgente luminosa

15 IL POTERE DI RISOLUZIONE Il potere di risoluzione (d) del microscopio è maggiore quando si utilizza luce nello spettro del blu (lunghezza d onda più breve pari a 500 nm o 0,5 µm) e un obiettivo con un apertura numerica elevata. L apertura numerica (n sen θ) può essere aumentata utilizzando diversi mezzi. L immersione in olio aumenta l indice di rifrazione (n; aria=1, olio=1,5). Il valore massimo di sen θ è 1 (sen 90 ). Modificazione dell apertura angolare (θ) con l immersione omogenea e non omogenea.

16 λ= da 200 nm (0,2 µm) luce ultravioletta a 900 nm (0,9 µm) luce nell infrarosso d = λ= 500 nm (0,5 µm) luce blu λ= 700 nm (0,7 µm) luce rossa 0,5 1 d = d = n aria = 1 n olio= 1,5 n sen θ con aria = 1 n sen θ con olio= 1,5 0,5 n sen θ d = 0,5 1,5 d = 0,7 n sen θ 0,7 1 d = d = 0,50 d = 0,33 d = 0,70 d = 0,46 0,7 1,5

17 Per aumentare il contrasto si possono colorare le cellule microbiche o le strutture batteriche mediante colorazioni semplici o differenziali (es. Gram reazione). Esistono diversi tipi di microscopi ottici: in campo chiaro, a contrasto di fase, in campo oscuro e ad interferenza. Colorazione semplice.

18 Tipi di microscopio Le cellule viventi prive di pigmenti non sono chiaramente visibili al microscopio in campo chiaro per la scarsa differenza di contrasto esistente tra le cellule e l acqua. Il microscopio in campo oscuro si ottiene collocando un diaframma per campo oscuro sotto il sistema delle lenti del condensatore di un microscopio ottico. In questo modo si crea un cono di luce cavo che colpisce l oggetto e solo la luce riflessa e rifratta proveniente dal campione formerà l immagine. Il microscopio a contrasto di fase trasforma piccole differenze dell indice di rifrazione e della densità cellulare in variazioni dell intensità luminosa facilmente individuabili. Fotomicrografia in campo chiaro (a), in campo oscuro (b) e a contrasto di fase (c).

19 Microscopia a fluorescenza Nella microscopia a fluorescenza il campione colorato con coloranti fluorescenti (fluorocromi) o dotato di fluorescenza naturale (autofluorescenza) esposto a luce con bassa lunghezza d onda (luce ultravioletta), emette luce a lunghezza d onda superiore. Un condensatore per campo oscuro consente di osservare l oggetto fluorescente che brilla sopra uno sfondo scuro. Osservazione a fluorescenza di batteri e alghe.