USO DEL MICROSCOPIO OTTICO

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1 USO DEL MICROSCOPIO OTTICO

2 STORIA DEL MICROSCOPIO FINE 1500 Olanda - Haus e Zacharias Janssen, esperti molatori, combinando tra loro diversi tipi di lenti, scoprirono che la capacità di ingrandimento poteva essere ulteriormente amplificata, ottenendo, al tempo stesso, un miglioramento nella definizione dell'immagine. 30 ingrandimenti 1624 Galileo Galilei, "Occhialino per vedere le cose minime" Adattamento del cannocchiale con una lente concava e una convessa montate su un tubo rigido FINE Anton van Leeuwenhoek Non era un accademico ma si dedicò all'ottico finchè le sue lenti divennero le migliori decisivo fu l'incontro con Regnier de Graaf che lo introdusse nella Royal Society. Scoperta PROTOZOI Scoperta BATTERI Robert Hooke -( ) perfezionò il microscopio avvalendolo di nuovi sistemi ottici e di un nuovo sistema di illuminazione, gli permisero una serie di scoperte esposte nel libro Micrographia: anatomia degli insetti cellule (nel sughero) osservazioni sui cristalli(cristallografia)

3 MICROSCOPIO COMPOSTO Per osservare dettagli di un oggetto lo avviciniamo agli occhi oppure usiamo una LENTE DI INGRANDIMENTO Una lente semplice non da mai più di 6-10 ingrandimenti 2 LENTE 1 LENTE IMMAGINE VIRTUALE SISTEMA DI LENTI :permette un ingrandimento maggiore in cui una seconda lente ingrandisce ulteriormente l immagine già ingrandita dalla prima lente. Su questo principio si basa il MICROSCOPIO COMPOSTO

4 MICROSCOPIO COMPOSTO Il principio alla base del funzionamento anche dei più complessi microscopi è il medesimo,ovvero quello messo a punto da Galilei: Stativo di Jackson Lister OCULARE Una lente o un sistema di lenti convergenti detto OBIETTIVO che ingrandisce l'oggetto OBIETTIVO L'immagine viene ulteriormente ingrandita da una seconda lente o sistema di lenti detta OCULARE INGRANDIMENTO TOT. = INGRANDIMENTO OBIETTIVO X INGRANDIMENTO OCULARE

5 Sfrutta il fenomeno della RIFRAZIONE OBIETTIVO Fornisce un'immagine REALE, INGRANDITA e CAPOVOLTA. L'oggetto è posto tra F (fuoco) e 2F. FUOCO REALE FUOCO VIRTUALE OCULARE Funziona come una lente di ingrandimento. Fornisce un'immagine VIRTUALE ULTERIRMENTE INGRANDITA. L'immagine fornita dall'obiettivo si forma tra il fuoco e zero.

6 L'OBIETTIVO Una lente o un sistema di lenti convergenti che ingrandisce l oggetto, l obiettivo. Gli obiettivi sono avvitati su una torretta girevole revolver e possono essere fino a sei. Il valore dell ingrandimento(20x,40x,60x,100x ) è inciso sulla montatura, insieme ad altre indicazioni. PLAN da un immagine piana del campione DIC adatto per microscopia ad interferenza obiettivi del all infinito /0.17 usare vetrini copri- oggetto di 0.17mm 160/- obiettivi che si possono usare senza vetrini copri oggetti

7 DALL'OBIETTIVO DIPENDE: IL POTERE DI RISOLUZIONE IL POTERE DI DEFINIZIONE IL POTERE DI INGRANDIMENTO

8 Un obiettivo è un sistema di lenti convergenti più o meno complesso a corta focale, che proiettal immagine ingrandita ed invertita del campione nel piano focale inferiore dell oculare in modo che questo possa vederla ed ingrandirla ulteriormente Sulla montatura sono riportate le caratteristiche dell'obiettivo tra cui l'apertura NUMERICA : parametro indicativo del potere di risoluzione dell obiettivo, quindi della sua qualità ottica APERTURA NUMERICA

9 Il fascio luminoso che parte dal campione diretto all obiettivo, è un cono di luce di ampiezza 2α. L'ampiezza dipende dall'indice di rifrazione n di ciò che c'è tra campione ed obiettivo 2α BASSO 2α ELEVATO Se c è aria, con n = 1, il valore di 2α sarà basso Se c è olio di cedro, con n = 1.5 il valore di 2α sarà elevato A.N.= n sen α Massima ampiezza del cono di luce che entra nell obiettivo.

10 Il potere di risolutivo è la capacità di distinguere come separati due punti, senza lenti l occhio umano distingue due particelle da 0.1mm a una distanza di 25cm solo se queste distano non meno di 5μm quindi il limite di risoluzione dell occhio umano è 5μm 5μm 0.1mm Il microscopio deve poter ingrandire l oggetto fino a che i punti di cui è costituita la sua immagine non siano visibili all occhio, cioè fino a che non distino tra loro più di 5 μ m APERTURA NUMERICA INDICE DI RIFRAZIONE DEL MEZZO LUNGHEZZA D ONDA DELLA LUCE CORREZIONE DELLE ABERRAZIONI

11 I raggi di luce che, partendo da una sorgente luminosa, convergono a formare il puntoimmagine di unpunto-oggetto, producono uno spot luminoso circondato da anelli di diffrazione. DISCO DI AIRY o DISCO DI CONFUSIONE R Il raggio (R) dipende dalla lunghezza d'onda (λ) della luce impiegata MASSIMA INTENSITA' LUMINOSA R=0.61λ /sen f Distribuzione dell'energia nel disco di Airy f è l angolo che i raggi di luce marginali formano con l asse ottico. Il valore di sen f corrisponde aquello dell A.N. (cioè n senα ). Tali considerazioni valgono quando il punto-oggetto è perfettamente a fuoco.

12 Se consideriamo due punti-oggetto di uguale diametro, adiacenti e molto vicini. Ciascuno di essi viene visto come un disco di Airy. Se i loro anelli di diffrazione sono in parte sovrapposti, i due dischi potranno essere visti come separati solo se il dislivello d tra le due curve energetiche sarà abbastanza elevato da essere visibile all occhio. I due dischi devono essere separati da una distanza almeno uguale al raggio di un disco di Airy LIMITE DI RISOLUZIONE minima distanza risolvibile, che è l inverso del potere di risoluzione R=0.61λ /A.N. R=0.61λ /n senα Maggiore è l apertura numerica, più vicini potranno essere i punti-oggetto visti separati.

13 POTERE DI RISOLUZIONE DIRETTAMENTE PROPORZIONALE all' A.N DIRETTAMENTE PROPORZIONALE all'indice di rifrazione del mezzo interposto INVERSAMENTE PROPORZIONALE alla lunghezza d'onda della luce (λ) DISTANZA DI LAVORO

14 L'uso del liquido è utile per fornire un percorso OMOGENEO alla luce. Obiettivo a secco : CAMBIA L'INDICE DI RIFRAZIONE PASSANDO DA UN MEZZO ALL'ALTRO VETRINO COPRI-OGGETTO n=1.53 ARIA n=1.00 VETRO DELLA LENTE n=1.53 Acqua distillata n=1.334 Glicerina n=1.450 Olio di cedro n=1.515 Olio sintetico n=1.518

15 LA QUALITA' OTTICA DIPENDE DALL'OBIETTIVO 1. Uso di luce monocromatica 2. I raggi di luce che provengono dall'oggetto devono essere paralleli all'asse ottico 3. L'apertura delle lenti molto piccola Queste condizioni non si riescono a verificare tutte contemporaneamente quindi si dice che il sistema ottico è affetto da ABERRAZIONI

16 ABERRAZIONE CROMATICA Usando LUCE BIANCA la lente si può comportare come un prisma L immagine e i suoi particolari saranno contornati da una frangia colorata e non saranno mai perfettamente nitidi. ACROMATICI Sono corretti in modo che vadano a fuocodue lunghezze d'onda, rosso e verde. Per rendere la luce monocromatica si usano filtri verdi ALLA FLUORITE (FL, FLUOR) Avvicinano ulteriormente i punti di fuoco dei raggi di diverso colore APOCROMATICI (APO) Sono corretti per tre lunghezze d onda: verde, rosso e blu.

17 ABERRAZIONE CROMATICA D'INGRANDIMENTO Le immagini formate da raggi di diversa lunghezza d onda (colore) vanno a fuoco nello stesso piano ma hanno dimensioni diverse Questa aberrazione viene corretta introducendone una uguale e contraria negli oculari, che sono detti oculari compensatori. Per evitare di dover usare due gruppi di oculari, compensatori e no, tutti gli obiettivi presentano un aberrazione cromatica ingrandimento, e di produrre solo oculari compensatori. di

18 ABERRAZIONE DI SFERICITA' La lente mette a fuoco i raggi più periferici in piani più vicini alla lente che non i raggi parassiali.(es. vetrino copri-oggetto di spessore inadatto.) Il risultato può essere la presenza di un alone policromo ai bordi del campo, e in ogni caso un immagine dai particolari poco definiti. Un obiettivo corretto per l aberrazione di sfericità è APLANATICO. C è sempre un residuo di aberrazione di sfericità anche nei migliori obiettivi.

19 CURVATURA DI CAMPO L immagine di un oggetto piano, quale può essere una sezione istologica, viene riprodotta concava o convessa, cioè sfuocata al centro o ai bordi Gli obiettivi corretti per la curvatura di campo sono detti PLANARI e riportano la scritta PLAN sulla montatura. In fotomicrografia devono essere usati esclusivamente obiettivi planari.

20 OBIETTIVI ALL'INFINITO Gli obiettivi sono calcolati per produrre un immagine intermedia, reale e invertita situata nel piano focale inferiore dell oculare. La distanza tra questo piano e il piano focale superiore dell obiettivo (lunghezza ottica del tubo del microscopio) viene di solito calcolata in modo che la lunghezza meccanica del tubo del microscopio sia di 160 o 170 mm Se la lunghezza meccanica del tubo varia, perché si inseriscono sistemi di variazione degli ingrandimenti, filtri, prismi o altri intermedi, l obiettivo non lavorerà al meglio..

21 Gli obiettivi all infinito hanno invece il sistema ottico calcolato per formare l immagine intermedia all infinito, in quanto da essi parte un fascio di luce a raggi paralleli. Lente situata nel tubo del microscopio farà sì che l immagine venga messa a fuoco ancora una volta nel piano focale inferiore dell oculare. LENTE INTERMEDIA Vantaggio: nel tubo del microscopio, sotto la lente intermedia, si possono inserire gli accessori necessari, senza alterare le caratteristiche ottiche degli obiettivi.

22 CONDENSATORE Il condensatore concentra, o condensa, il fascio luminoso che proviene dall illuminatore, sul piano del campione, che da qui raggiunge il piano focale posteriore dell obiettivo. Il diaframma del condensatore, (diaframma di apertura) è importante per poter inviare all obiettivo un cono di luce adatto alla sua apertura numerica.

23 In questa figura la massima A.N. dell obiettivo è sfruttata solo da una parte del fascio di proveniente dal condensatore. luce Aprendo o chiudendo opportunamente il diaframma di apertura si avvicina l A.N. del condensatore all A.N. dell obiettivo. il condensatore DEVE essere regolato in altezza, pena la comparsa di distorsioni cromatiche e scadimento della nitidezza

24 Il tavolino dà appoggio al campione ed è provvisto di mollette di fermo o di dispositivi traslatori del vetrino. Di solito è rettangolare, ma può essere anche circolare, fisso o girevole, per studi in luce polarizzata o semplicemente per meglio orientare il campione Il condensatore è un sistema di lenti con la funzione di inviare all obiettivo la quantità di luce adatta alle sue caratteristiche ottiche. Deve essere regolabile in altezza e lo si deve poter centrare. E' provvisto di un diaframma di apertura per regolare l'ampiezza del cono di luce che entra nell'obiettivo

25 La vite macrometrica serve per un primo grossolano controllo della messa a fuoco del campione la vite micrometrica permette la messa a fuoco di precisione L illuminatore è ormai incorporato in tutti i moderni microscopi, anche i più semplici, e la lampada, a bassa tensione, è regolabilemediante un reostato MICROMETRICA ll diaframma dell illuminatore, o diaframma di campo, regola l ampiezza del fascio di luce che arriva al condensatore e delimita il campo microscopico visibile, contribuendo in tal modo al controllo della qualità dell immagine. Deve essere aperto fino a scomparire dal campo visivo. MACROMETRICA DIAFRAMMA DI CAMPO

26 L'OCULARE L oculare è un semplice sistema di lenti che vede ed ingrandisce l immagine del campione già ingrandita dall obiettivo. Può essere unico oppure doppio, per una osservazione più comoda MONOCULARE BINOCULARE L oculare porta inciso un numero sulla montatura, che indica il suo potere di ingrandimento di solito 10x. L occhio deve essere avvicinato all oculare fino a quando i raggi di luce uscenti dal microscopio non convergono e il campo visivo non raggiunge la massima estensione. Distanza interoculare deve essere regolata in modo che i due campi visivi non si fondono in uno solo. Aggiustamento diottrico, si mette a fuoco prima con l occhio destro quindi tenendo chiuso il destro, si ruota la righiera di regolazione dell oculare sinistro fino a mettere a fuoco il campione.

27 I microscopi biologici dispongono di ottiche in grado di raggiungere ingrandimenti molto elevati, dai 20x fino a 1000x e oltre. L'obiettivo di osservazione è singolo l'immagine risulterà bimensionale. Stereo microscopi sono caratterizzati da una visione 3D di ciò che si sta osservando in quanto sono dotati di coppie di obiettivi e oculari che lavorano simultaneamente dando una visione realistica del soggetto. (10x a 90x fino 180x) MICROSCOPIO MONOCULARE MICROSCOPIO BINOCULARE MICROSCOPIO TRINOCULARE MICROSCOPIO INVERTITO MICROSCOPIO POLARIZZATORE MICROSCOPIO A CONTRASTO DI FASE.

28 ALTRI TIPI Microscopio a campo chiaro in cui il fondo è chiaro mentre l oggetto,il tessuto l organismo appare colorato. Microscopio a campo oscuro il fondo appare nero mettendo in evidenza il preparato che appare chiaro Microscopio a contrasto di fase Si basa sul fenomeno dell'interferenza luminosa.il preparato viene illuminato da un fascio luminoso in realtà suddiviso a livello del condensatore in due porzioni di fase differente e con diverso angolo di incidenza Microscopio a fluorescenza sfrutta fenomeni di fluorescenza e fosforescenza indotti nel campione Microscopio polarizzatore polarizza il fascio di luce su un determinato piano Microscopio a interferenza differenziale è basato sui diversi indici di rifrazione delle varie parti del preparato Microscopio confocale funziona come un laser evidenziando i vari piani del preparato.

29 L illuminazione secondo Kohler Il metodo è costituito da tre fasi successive: 1. Centratura e regolazione in altezza del condensatore Si focalizza con un piccolo ingrandimento un preparato, si chiude il diaframma di campo mentre si apre il diaframma di apertura e si alza al massimo il condensatore, lo si centra con le apposite manopole. Lo si regola in altezza fino ad avere l immagine con i bordi nitidi. 2. Regolazione del diaframma di campo Il diaframma di campo si deve aprire fin quando non sparisce appena dal campo visivo, ed è un operazione da rifare ad ogni cambio di obiettivo. 3. Regolazione del diaframma di apertura La regolazione del diaframma di apertura garantisce un immagine con il miglior contrasto e con la migliore risoluzione. Quest operazione è per lo più affidata all esperienza, ma in linea di massima il diaframma si deve chiudere lentamente ed appena l occhio nota una variazione di contrasto lo si riapre appena,ad ogni modo meglio che il diaframma sia un po più aperto del dovuto piuttosto che troppo chiuso. Anche questa è un operazione da svolgere ad ogni cambio d ingrandimento.