Analisi omiche su sangue e urine

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1 Analisi omiche su sangue e urine Autori Vittorio Sirolli Massimo Papale (redattore) Gianluigi Zaza (redattore) Francesco Trepiccione (collaboratore) Contenuti 1. Abstract 2. Sangue Separazione Plasma Separazione siero Isolamento cellulare 3. Urine Premesse Raccolta campioni Dosaggio proteico

2 Abstract release 1 pubblicata il 20 luglio :02 da Vittorio Sirolli ANALISI OMICHE SU SANGUE ED URINE Sangue Urine Estensore: Gianluigi Zaza Revisore: Fulvio Magni Estensori: Massimo Papale, Francesco Trepiccione Revisore: Giovanni Candiano Sangue release 1 pubblicata il 20 luglio :02 da Gianluigi Zaza Separazione Plasma Pazienti a digiuno. 1. Effettuare il prelievo di sangue intero (generalmente 10 o 20 ml) da una vena periferica con provette contenenti K3 EDTA; 2. centrifugare entro due ore dal prelievo, a3000 gper 10 min alla temperatura di4 C; 3. prelevare il plasma (surnatante) con pipette adeguate, facendo attenzione a non aspirare il pellet che si forma sul fondo della provetta e dividerlo in aliquote (per esempio: da 1.5 ml) in provette adatte alla crioconservazione (tale procedura è essenziale per evitare ripetuti congelamenti e scongelamenti); 4. conservare tutte le provette, in scatole da congelamento, a-80 Cfino al loro utilizzo. Separazione siero Pazienti a digiuno dalla mezzanotte. 1. Effettuare il prelievo di sangue intero da una vena periferica con provette senza anticoagulante (provette vuote per siero) rispettando gli standard di sterilità/asepsi; 2. mantenere il prelievo a temperatura ambiente per un intervallo di tempo compreso tra 30 e 45 minuti per favorire la formazione del coagulo; 3. centrifugare il sangue a 3000 rpm per 15 minuti a temperatura ambiente; 4. Dividere il surnatante in aliquote (es. da 1 ml) in provette adatte alla crioconservazione (tale procedura è essenziale per evitare ripetuti congelamenti e scongelamenti); 5. conservare tutte le aliquote, in scatole da congelamento, a-80 Cfino al loro utilizzo. Isolamento cellulare A. Isolamento linfomonociti Materiale necessario per la raccolta del campione e per la procedura di isolamento: Pag. 2 di 6

3 Provette contenenti per esempio eparina, citrato, EDTA (volume delle provette da definire in relazione agli esperimenti pianificati); Soluzione di Ficoll-Hypaque; Phosphate-Buffer Solution (PBS) 1X ph7.4/1mm EDTA senza Ca++ e Mg++ ; Tubi per centrifuga con volume di 50 ml; Colorante Trypan blue; Medium di congelamento composto da: 90% siero fetale di bovino (FBS) + 10% dimetilsolfossido (DMSO); Una serie di vials. Procedimento: 1. Effettuare il prelievo di sangue intero (generalmente 10 o 20 ml) da una vena periferica con provette contenenti litio-eparina rispettando gli standard di sterilità/asepsi; 2. Se possibile, effettuare le procedure di isolamento in tempi brevi o conservare il campione per breve periodo di tempo a temperatura di circa 4 Cprocedendo al suo mescolamento continuo (attraverso rulli); 3. In laboratorio, diluire il sangue intero attraverso l utilizzo di PBS 1X ph7.4 / 1mM EDTA senza Ca++ e Mg++ rispettando un rapporto di 1:2; 4. Porre 10 ml di soluzione di Ficoll-hypaque in un tubo da centrifuga e stratificare su di questa 20 ml di sangue diluito utilizzando una pipetta pasteur; 5. Centrifugare la suddetta soluzione a 460 gper 30 minuti a temperatura ambiente (questa manovra consentirà la formazione di anelli e l individuazione di quello relativo ai LMP) (A); 6. Raccogliere con un'altra pipetta Pasteur l'anello relativo ai LMP (per tale operazione si consiglia di porre la punta della pipetta al di sopra dell'anello) (B); 7. Riporre l anello dei LMP in nuovi tubi da 50 ml e procedere alla diluizione del contenuto con PBS 1X ph7.4/1mm EDTA fino al raggiungimento di un volume finale di 40 ml; 8. Mescolare per inversione; 9. Centrifugare a 250 gper 12 minuti alla temperatura di 4 C; 10. Eliminare il surnatante e riunire i due pellet in un unico tubo da 50 ml e aggiungere PBS 1X ph7.4/ 1mM EDTA fino a un volume finale di 40 ml; 11. Mescolare per inversione; 12. Centrifugare a 175 gper 12 minuti alla temperatura di 4 C; 13. Eliminare il surnatante e risospendere il pellet in 10 ml di PBS 1X ph7.4/1mm EDTA; 14. Prelevare circa 1 ml di sospensione cellulare e procedere con la conta in trypan blue (v. Tabella 1 [documento a parte]); 15. Centrifugare a110 gper 12 minuti alla temperatura di 4 C; 16. Eliminare il surnatante e risospendere il pellet nel medium di congelamento composto da: 90% siero fetale di bovino (FBS) + 10% dimetilsolfossido (DMSO); 17. Conservare le cellule a -80 Covernight e poi trasferirle in azoto liquido. Si consiglia di conservare un quantitativo di cellule pari a 10 milioni/vial. Tale procedura renderà possibile l utilizzo delle suddette cellule per esperimenti successivi (estrazione degli acidi nucleici, proteine, esperimenti con colture cellulari). Dai LMP prelevati dal sangue intero è possibile effettuare successivamente l isolamento delle sottopopolazioni linfocitarie (Th1, Th2 etc.) attraverso varie metodiche (per esempio metodiche di Pag. 3 di 6

4 sorting immunomagnetico) e seguendo le procedure riportate dalle ditte produttrici dei kit di isolamento. B. Isolamento Eritrociti 1. Effettuare il prelievo di sangue intero da una vena periferica con provette contenenti ammonio eparina o EDTA rispettando gli standard di sterilità/asepsi; 2. centrifugare il sangue a1000 gper 10 minuti a temperatura ambiente; 3. eliminare il buffy coat e il plasma arricchito in piastrine; 4. effettuare 2 lavaggi con Hanks' Balanced Salt Solution; 5. risospendere le cellule in Hanks' Balanced Salt Solution; 6. aliquotare le cellule in provette da 1,5 ml; 7. conservare le cellule a-80 Cfino al loro utilizzo. C. Isolamento delle Piastrine Riferirsi ai vari protocolli presenti in letteratura individuando la procedura più idonea alla tipologia di esperimento da effettuare. Documenti allegati Tabella 1 Urine release 1 pubblicata il 20 luglio :02 da Massimo Papale Premesse L urina è un liquido biologico potenzialmente ricco di informazioni sulla funzionalità renale, tuttavia la composizione dell urina viene costantemente influenzata dallo stato metabolico di ciascun individuo, dalle abitudini alimentari, dall assunzione di farmaci, dallo stile di vita e, in special modo per le donne, dai cicli ormonali. Per ogni soggetto che verrà esaminato occorre quindi considerare 1. età, 2. sesso, 3. abitudini alimentari, 4. patologia 5. assunzione di farmaci. Inoltre occorre prevedere il reclutamento di un ampio numero di soggetti per ridurre l influenza dei fattori di confondimento non legati alla patologia oggetto di studio. Poiché la composizione quali/quantitativa delle urine varia in base al volume urinario, per ciascun paziente, è indispensabile annotare volume urinario nelle 24 ore. Pag. 4 di 6

5 Inoltre, sul primo campione urinario del mattino, andranno eseguiti: 1. esame urine 2. urinocoltura 3. dosaggio clinico (laboratorio centralizzato dell Ospedale) di proteinuria e creatininuria. Raccolta campioni Per studi su proteine solubili Per ciascun paziente raccogliere ~200 ml di urine del mattino (seconda minzione) in contenitori da urinocoltura sterili Le urine possono essere conservate a 4 Cper non più di 2 ore prima del processamento Centrifugare le urine a x g per 10 a temperatura ambiente per rimuovere cellule e detriti cellulari (conservare il pellet cellulare a-80 C, annotandone quantità, colore, consistenza) Trasferire il surnatante in tubi Falcon puliti facendo attenzione a non far rimescolare l eventuale pellet depositato sul fondo della provetta, dividendo le urine in 4 tubi Falcon da 50 ml Etichettare e conservare a-80 Ccome urine stock. Per isolamento degli esosomi Usare contenitori sterili come da urinocoltura. Raccogliere un campione d urina dal secondo mitto della giornata e congelarlo subito a -80 C. La quantità richiesta per ogni soggetto dipende ovviamente dalla numerosità della popolazione in studio; principio guida deve essere che 1 lt di urina di individui adulti consente l isolamento di circa 100 ug di proteine esosomiali. Organizzare il trasferimento presso il laboratorio di analisi in ghiaccio secco. Dosaggio proteico Metodo Breadford Il dosaggio Bradford è un metodo basato sul legame del colorante Blue Comassie G-250 alle proteine. A ph acido il colorante libero ha due picchi di assorbimento nel visibile, a 470 e a 650 nm; quando si lega ad una proteina ha un picco massimo di assorbimento a 595 nm (Figura 1). Vantaggi: Svantaggi Reagente Sensibilità del metodo fino a concentrazioni di 20 mg/ml; Semplicità di preparazione del reattivo; Sviluppo del colore immediato e stabilità del complesso. Il metodo è relativo, perché la quantità di colorante che si lega alla proteina dipende dal contenuto in aa basici presenti; Difficile scelta di uno standard; Molte proteine sono insolubili in ambiente acido. Pag. 5 di 6

6 Reagente cromogeno Bio-Rad Protein Assay 450mL (solution of Comassie Brilliant Blue G-250) Esecuzione del dosaggio: Figure Standard BSA (Bovine Serum Albumin) per retta di taratura: 0 ml, 12.5 ml, 25 ml, 50 ml, 75 ml, 100 ml della soluzione madre di BSA 0.2 mg/ml (corrispondenti rispettivamente a 0 mg, 2,5mg, 5 mg, 10 mg,15 mg, 20mg di proteina) portati ad un volume finale di 800 ml con H2O mq in 6 eppendorf distinte. Campioni urinari : 2 ml di campione portato ad un volume finale di 800 ml con H2O mq Bianco della reazione: 800 ml di H2O mq A ciascuna eppendorf (campioni, standard, bianco) si aggiungono 200 ml di reagent cromogeno. Ogni eppendorf viene vortexata e incubata a temperatura ambiente per almeno 5 minuti. L assorbanza viene letta allo spettrofotometro alla lunghezza d onda di 595 nm. Viene costruita una retta di taratura della BSA (asse delle ascisse concentrazioni in mg /ml degli standard, asse delle ordinate Assorbanza corrispondente) Figura 1. Pag. 6 di 6