Acido 3,5-dinitrosalicilico Glucosio Acido 3-amino-5-nitrosalicilico Acido gluconico (Incolore-giallo leggero)

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Dario Bianchini
6 anni fa
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1 1 Determinazione di zuccheri riducenti e di amido in banana in relazione alle condizioni di conservazione (Corso di Fisiologia della produzione e della post-raccolta) In banana durante il processo di maturazione avviene la trasformazione dell amido in zuccheri riducenti (glucosio e fruttosio) e saccarosio. A maturazione, la % di zuccheri riducenti è l 8 %, di saccarosio il 10 % e di amido il 2 %. Per l analisi degli zuccheri riducenti viene utilizzato l acido 3,5 dinitrosalicilico (DNS) in presenza di sodio potassio tartrato. Il saggio con DNS è un test colorimetrico che si basa su una reazione redox: il gruppo aldeidico del glucosio e il gruppo chetonico del fruttosio vengono ossidati, mentre contemporaneamente l'acido 3,5-dinitrosalicilico viene ridotto in condizioni alcaline ad acido 3-amino-5-nitrosalicilico, un composto rossastro che allo spettrofotometro assorbe a 540 nm. Il sodio potassio tartrato limita l ossigeno disciolto in soluzione che altrimenti interferirebbe con l ossidazione del glucosio. Acido 3,5-dinitrosalicilico Glucosio Acido 3-amino-5-nitrosalicilico Acido gluconico (Incolore-giallo leggero) (Rosso) In questa esercitazione vengono analizzati l amido e gli zuccheri riducenti (fruttosio e glucosio) contenuti in banane verdi e conservate per sette giorni in varie condizioni: - in frigo (T = 4 C); - sul banco (T ambiente); - all interno di un sacchetto di carta (T ambiente) - all interno di un active packaging (T C).

2 2 Materiali - Banane - Mortaio e pestello - Acqua distillata - Acido 3,5-dinitrosalicilico, glucosio, NaOH, tartrato di sodio e potassio, acetone - Tubi Corex da 15 ml, adattatori - Cilindri da 25 e 50 ml - Imbuto Buchner grande + filtri di carta - Provette in plastica (5 ml) + rack - Pipette in plastica - Gilson (da 1000 μl, 200 μl e 20 μl) + puntali - Termostatato per bagnomaria a 100 C (reazione con DNS); beaker da 500 ml - Capsule Petri grandi - Spettrofotometro e cuvette da 1 ml Metodologia A. Conservazione banane Sette giorni prima dell analisi alcune banane verdi vengono collocate in frigo, sul banco, in un active packaging e in un sacchetto di carta. B. Preparazione dei reattivi - Standard di glucosio (1.0 mg/ml) Pesare circa 0,05 g (50 mg) di glucosio e portarlo in soluzione con circa 25 ml di acqua. Agitare fino a completa dissoluzione e travasare in un cilindro da 50 ml, portando successivamente a volume. Calcolare la concentrazione effettiva di glucosio, utilizzando il dato della pesata. (dopo avere preparato la soluzione, fare la curva di taratura come descritto al punto E). - Soluzione di NaOH 2M (40 ml) - Acido 3,5-dinitrosalicilico (DNS) Sciogliere 2 g di DNS in 40 ml di una soluzione di NaOH 2M. Aggiungere altri 100 ml di acqua. Sciogliere 60 g di tartrato di sodio e potassio nella soluzione del DNS e portare il tutto ad un volume finale di 200 ml con acqua distillata. Conservare in un contenitore ben chiuso, per proteggere il reagente dall azione della CO 2.

3 3 C. Isolamento degli zuccheri solubili - Pesare 1 g (max) di ciascun campione di banana delle diverse tesi. - Riportare il peso effettivo in tabella al punto G; - Omogeneizzare il campione in un mortaio con ml di acqua (6 ml per l omogeneizzazione + 6 ml per il lavaggio); trasferire l omogenato in un tubo Corex. - Centrifugare l omogenato a 4000 rpm per 10 min; - Decantare il surnatante in un cilindro da 25 ml; - Risospendere il pellet in 6 ml di acqua aiutandosi con una bacchetta di vetro e centrifugare di nuovo a 4000 rpm per 10 min (bypassare questo step); - Aggiungere il surnatante a quello raccolto precedentemente e misurare accuratamente il volume e riportare il valore in tabella al punto G; - Travasare il surnatante in una provetta; - Conservare il pellet per l isolamento dell amido. D. Isolamento dell amido - Per isolare l amido dal campione risospendere il pellet con 10 ml di acqua utilizzando una spatolina; - Preparare un filtro di carta per il Büchner (pesare il filtro prima di filtrare e riportare il dato in tabella); - Filtrare la sospensione; - Risciacquare le provette con altri 10 ml di acqua e filtrare di nuovo, cercare di trascinare più solido possibile; - Lavare il pellet con 10 ml di acetone; questo aiuterà il pellet ad asciugarsi più in fretta. - Trasferire il filtro su una capsula Petri di vetro e lasciarla asciugare su un termostato a 70 C - Pesare il filtro di carta con amido e riportare il dato in tabella. - Per differenza si ottiene l amido presente nel campione. - Calcolare la % di amido presente nei campioni. E. Preparazione della curva di taratura per la misura del contenuto di zuccheri riducenti - Utilizzando la soluzione di glucosio 1,0 mg/ml, ogni gruppo prepara una serie di 7 provette, aggiungendo glucosio standard e acqua come indicato in tabella:

4 4 N provetta Standard Glucosio (ml) Acqua (ml) Volume totale (ml) Bianco Aggiungere in ogni provetta 2 ml di DNS (volume totale = 3 ml); - Mettere le provette in un bagnomaria bollente per 5 min (reazione); - Raffreddare le provette in acqua fredda (stop reazione); - Agitare con cura e misurare l Abs a 540 nm con lo spettrofotometro (dopo avere tarato lo strumento con il bianco ); F. Misura della quantità di zuccheri riducenti nell estratto di banana - Ogni gruppo preparerà quattro provette (1 bianco più tre campioni) secondo lo schema seguente: N provetta Acqua (ml) Estratto (ml) Bianco Banana verde (acerba) Banana conservata in: Banana conservata in: A seconda del grado di maturazione della banana sarà necessario diluire il campione; - Aggiungere in ogni provetta 2 ml di DNS (volume totale = 3 ml); - Mettere le provette in un bagnomaria bollente per 5 min (il DNS con la temperatura diventa rosso scuro); - Raffreddare le provette in acqua fredda; - Agitare con cura e misurare l Abs a 540 nm con lo spettrofotometro.

5 5 G. Determinazione della percentuale di zuccheri riducenti - Utilizzando la curva di taratura determinare la quantità di zuccheri riducenti presenti nell estratto. - Calcolare la % di zuccheri riducenti nell estratto. Esempio (con un estratto di 15 ml di volume): Lettura con 0.1 ml di estratto Abs = 0.306; se questo valore di Abs corrisponde a 0.2 mg di glucosio sulla curva di taratura, avremo: 0.2 mg : 0.1 ml = X (mg di glucosio nell estratto) : 15 ml (volume estratto) 15 ml 0.2 X = = 30 mg di glucosio (= mg zuccheri riducenti) 0.1 ml Si esprime infine il valore in percentuale: 30 mg : 1 g (p.f. ) = x : 100 g (p.f.) x = = 3000 mg = 3 g in 100 g = 3 % 1

6 6 Glucosio Standard ( mg / ml) Peso campione (g) Volume estratto (ml) Abs a 540 nm % zuccheri riducenti Campioni Bianco Campione 1: Campione 2: Campione 3: Campione 4: Campione 5: Campione 6: AMIDO Peso filtro Peso filtro + amido Campione 1: Campione 2: Campione 3: Differenza in peso % di amido

7 Abs mg Glucosio standard Domande 1. Qual è secondo voi il miglior metodo di conservazione delle banane? 2. E possibile determinare con questo metodo la % di saccarosio?

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