Determinazione di zuccheri riducenti e di amido in banana in relazione alle condizioni di conservazione

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1 1 Determinazione di zuccheri riducenti e di amido in banana in relazione alle condizioni di conservazione In banana durante il processo di maturazione avviene la trasformazione di amido in zuccheri riducenti (glucosio e fruttosio) e saccarosio. A completa maturazione la % di zuccheri riducenti è l 8 %, di saccarosio il 10 % e di amido il 2 %. Per l analisi degli zuccheri riducenti viene utilizzato l acido 3,5 dinitrosalicilico (DNS) in presenza di sodio potassio tartrato. Il saggio con DNS è un saggio colorimetrico che si basa su una reazione redox: il gruppo aldeidico del glucosio e il gruppo chetonico del fruttosio vengono ossidati, mentre contemporaneamente l'acido 3,5-dinitrosalicilico viene ridotto, in condizioni alcaline, ad acido 3- amino-5-nitrosalicilico, un composto rossastro che assorbe a 540 nm. Il sodio potassio tartrato limita l ossigeno disciolto in soluzione che altrimenti interferirebbe con l ossidazione del glucosio. Acido 3,5-dinitrosalicilico Glucosio Acido 3-amino-5-nitrosalicilico Acido glucuronico (Incolore) (Rosso) In questa esercitazione vengono analizzati l amido e gli zuccheri riducenti (fruttosio e glucosio) contenuti nelle banane: - banane immature (verdi) sono state conservate per sette giorni sul banco, in un sacchetto di plastica e trattate per 48 h con 1-MCP.

2 2 Materiali - Banane - Mortaio e pestello - Pipette e puntali - Acqua distillata, acido 3,5-dinitrosalicilico, NaOH, tartrato di sodio e di potassio, acetone. Metodologia A. Conservazione banane Sette giorni prima dell analisi le banane verdi vengono collocate sul banco, in un sacchetto di plastica e trattate per 48 h con 1-MCP (almeno due per trattamento). B. Preparazione dei reattivi - Standard di glucosio (1.0 mg/ml) Pesare circa 0,05 g (50 mg) di glucosio e portarlo in soluzione con circa 25 ml di acqua. Agitare fino a completa dissoluzione e travasare in un cilindro da 50 ml, portando successivamente a volume. Calcolare la concentrazione effettiva di glucosio, utilizzando il dato della pesata. - Soluzione di NaOH 2M - Acido 3,5-dinitrosalicilico (DNS) Sciogliere 2 g di DNS in 40 ml di una soluzione di NaOH 2M. Aggiungere altri 100 ml di acqua. Sciogliere 60 g di tartrato di sodio e potassio nella soluzione del DNS e portare il tutto ad un volume finale di 200 ml con acqua distillata. Conservare in un contenitore ben chiuso, per proteggere il reagente dall azione della CO 2. C. Isolamento degli zuccheri solubili - Pesare 1 g (max): di ciascun campione di banana delle diverse tesi. - Riportare il peso effettivo in tabella al punto G; - Omogeneizzare il campione in un mortaio con 6+6 ml di acqua; - Centrifugare l omogenato a 4000 rpm per 10 min; - Decantare il surnatante in un cilindro da 25 ml; - Risospendere il pellet in 6 ml di acqua aiutandosi con una bacchetta di vetro e centrifugare di nuovo a 4000 rpm per 10 min. - Aggiungere il surnatante a quello raccolto precedentemente e misurare accuratamente il volume e riportare il valore in tabella al punto G; - Travasare il surnatante in una provetta; - Conservare il pellet per l isolamento dell amido;

3 3 D. Isolamento dell amido - Per isolare l amido dal campione risospendere il pellet con 10 ml di acqua utilizzando una bacchetta di vetro; - Preparare un filtro di carta per il Büchner (pesare il filtro prima di filtrare ed annotare la massa e riportare il dato in tabella); - Filtrare la sospensione; - Risciacquare le provette con altri 10 ml di acqua e filtrare di nuovo, cercare di trascinare più solido possibile; - Lavare il pellet con 10 ml di acetone, questo aiuterà il pellet ad asciugarsi più in fretta. - Trasferire il filtro su una capsula petri di vetro e lasciarla asciugare. - Se necessario collocarlo in stufa. - Pesare il filtro di carta con amido e riportare il dato in tabella. Per differenza si ottiene l amido presente nel campione. Calcolare la % di amido presente nei campioni. E. Preparazione della curva di taratura per la misura del contenuto di zuccheri riducenti - Utilizzando la soluzione di glucosio 1,0 mg/ml preparare una serie di provette come indicato - in tabella: N provetta ml di standard ml di acqua ml volume totale Bianco Aggiungere in ogni provetta 2 ml di DNS; - Mettere le provette in un bagnomaria bollente per 5 min; - Raffreddare le provette in acqua fredda; - Agitare con cura e misurare l Abs a 540 nm; - Con i valori di Abs costruire la curva di taratura;

4 4 F. Misura della quantità di zuccheri riducenti nell estratto di banana - Ogni gruppo preparerà quattro provette (1 bianco più tre campioni) secondo lo schema seguente: N provetta ml di acqua ml di estratto Bianco Banana verde Banana conservata: Banana conservata: A seconda del grado di maturazione della banana sarà necessario diluire il campione. - Aggiungere in ogni provetta 2 ml di DNS; - Mettere le provette in un bagnomaria bollente per 5 min; - Raffreddare le provette in acqua fredda; - Agitare con cura e misurare l Abs a 540 nm; G. Determinazione della percentuale di zuccheri riducenti - Utilizzando la curva di taratura determinare la quantità di zuccheri riducenti presenti nei campioni. Calcolare la media per le ripetizioni. - Calcolare la % di zuccheri riducenti nei campioni. Esempio: con 0.1 ml di campione, Abs = 0.306; questo valore di Abs = 0.2 mg di glucosio; 0.2 mg : 0.1 ml = x : 15 ml (volume campione) 15 ml x 0.2 X = = 30 mg 0.1 ml 30 mg : 1 g (pf) = x : 100 g (pf) 30 x 100 X = = 3000 mg = 3 g in 100 g = 3 % 1

5 5 Glucosio Standard ( mg / ml) Peso (g) Volume (ml) Abs a 540 nm % zuccheri riducenti Campioni Bianco Campione 1: Campione 2: Campione 3: Campione 4: Campione 5: Campione 6: AMIDO Peso filtro Peso filtro + amido Campione 1: Campione 2: Campione 3: Differenza in peso % di amido

6 Abs 6 Curva di taratura 1,8 1,7 1,6 1,5 1,4 1,3 1,2 1,1 1 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0, ,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1 1,1 mg/ml Domande 1. Qual è secondo voi il miglior metodo di conservazione delle banane? 2. E possibile determinare con questo metodo la % di saccarosio?