PURIFICAZIONE E CARATTERIZZAZIONE BIOCHIMICA DI UNA TREALASI DI INSETTO ESPRESSA COME PROTEINA ETEROLOGA IN Escherichia coli.

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1 PURIFICAZIONE E CARATTERIZZAZIONE BIOCHIMICA DI UNA TREALASI DI INSETTO ESPRESSA COME PROTEINA ETEROLOGA IN Escherichia coli. La trealasi (α,α-trealosio glucoidrolasi EC ) è un enzima che catalizza l idrolisi del disaccaride trealosio in due molecole di glucosio che può così essere disponibile sia come fonte energetica sia come precursore della chitina. Negli insetti la trealasi svolge un ruolo fondamentale, essendo il trealosio e non il glucosio il principale zucchero circolante nell emolinfa. Il cdna codificante la trealasi del moscerino Chironomus riparius è stato inserito nel plasmide pmal-c5x e il ceppo di E. coli BL21 è stato trasformato con il costrutto così ottenuto. La produzione della proteina di interesse, fusa con la maltose binding protein (MBP), avviene a seguito dell induzione con IPTG. L obiettivo di questa esperienza è quello di purificare la proteina chimerica trealasi- MBP e di procedere alla caratterizzazione biochimica della trealasi. I GIORNO Preparazione dei campioni analitici I campioni analitici sono in larga parte destinati ad elettroforesi in condizioni denaturanti. - prelevare un aliquota (15 µl) di estratto totale e trasferirlo in provetta da 1,5 ml, da tenere in ghiaccio. Questo campione ( proteine totali ) sarà sottoposto ad analisi SDS-PAGE (v. tabella a pag. 5). - prelevare un aliquota (150 µl) di estratto totale e centrifugare per 5 min a rpm. Con questo passaggio ( chiarificazione dell estratto) si ottiene la separazione della frazione proteica solubile e di quella insolubile. - trasferire il surnatante chiarificato in una provetta da 1,5 ml, da tenere in ghiaccio. Nei prossimi giorni, questo campione ( proteine solubili ) sarà 1

2 sottoposto ad analisi SDS-PAGE (v. tabella a pag. 5). a saggi di attività e del contenuto proteico - dopo aver rimosso tutto il surnatante, porre la provetta con il pellet ( frazione insolubile ) in ghiaccio. Questo campione ( proteine insolubili ) sarà sottoposto ad analisi SDS-PAGE (v. tabella a pag. 5). Preparazione dei campioni preparativi - trasferire l estratto totale in 2 provette da 2 ml e centrifugare per 5 min a rpm. - trasferire il surnatante (frazione di proteine solubili) in una provetta da 4 ml che viene posta in ghiaccio (campione preparativo proteine solubili ). Questo campione sarà sottoposto a cromatografia di affinità. Cromatografia di affinità La trealasi-mbp viene purificata mediante cromatografia di affinità utilizzando una resina coniugata con amilosio. Equilibrazione della resina in tampone A (operazione già eseguita) - Aggiungere 0,5 ml di tampone A nella provetta contenente 0.4 ml di resina - Mescolare per inversione e centrifugare a 2000 rpm per 3 minuti - Allontanare il surnatante ed eseguire altri 4 lavaggi (volume totale: 2 ml, 4 volumi di colonna). Binding alla resina - Aggiungere alla resina il campione preparativo proteine solubili - Incubare a temperatura ambiente per 1 h in agitazione su ruota - Trasferire in colonna la sospensione di resina e campione preparativo, lasciare sedimentare e raccogliere il picco escluso, ossia tutto ciò che non si lega alla resina (conservare in ghiaccio). Washing - Lavare con 15 volumi di colonna (6 ml) di tampone A (scartare) 2

3 Eluizione - Eluire in 5 frazioni da 1 ml di tampone B (frazioni di eluizione = nuovo campione preparativo). Porre in ghiaccio. Tamponi per la purificazione - Preparare 10 ml di Tampone A (Tris- HCl 20 mm, NaCl 200 mm, EDTA 1mM, DTT 1mM, ph 7.4) partendo dalle seguenti soluzioni madre: Tris- HCl 200 mm ph 7.4 NaCl 1 M EDTA 100 mm DTT 100 mm Portare al volume prescritto aggiungendo acqua q.b. - Preparare 10 ml di Tampone B (Tris- HCl 20 mm, NaCl 200 mm, EDTA 1mM, DTT 1mM, maltosio 50 mm ph 7.4) partendo dalle seguenti soluzioni madre: Tris- HCl 200 mm ph 7.4 NaCl 1 M EDTA 100 mm DTT 100 mm Maltosio 500 mm Portare al volume prescritto aggiungendo acqua q.b. 3

4 Preparazione del gel di poliacrilamide in presenza di SDS (SDS-PAGE) L andamento della purificazione viene monitorato mediante analisi SDS-PAGE. In questo tipo di elettroforesi, condotta in condizioni denaturanti, si utilizza un sistema discontinuo di gel di poliacrilamide: si ha un running gel a ph 8.8, con una percentuale di poliacrilamide che può variare tra il 7 e il 15% (in questo caso il 10%) e uno stacking gel a ph 6.8, con una percentuale di poliacrilamide del 4%. La presenza dello stacking gel consente una compattazione delle bande proteiche che entrano sotto forma di bande molto sottili nel running gel, dove verranno separate in base alla loro massa molecolare. Il gel necessario alla separazione elettroforetica viene allestito come indicato di seguito. I campioni sono stati preparati per aggiunta di SDS-sample buffer. Running gel 10% (10 ml) H 2 O distillata 4.1 ml 1,5 M Tris/HCl, ph 8.8, 0.4% SDS 2.5 ml Acrilamide/Bisacrilamide 30% 3.3 ml Stacking gel 4% (3 ml) Ammonio persolfato (100 mg/ml) 90 µl TEMED 10 µl H 2 O distillata 1.8 ml 0.5 M Tris/HCl, ph 6.8, 0.4% SDS 750 µl Acrilamide/Bisacrilamide 30% 400 µl Ammonio persolfato (100 mg/ml) 30 µl TEMED 10 µl N.B: Ammonio persolfato (iniziatore) e TEMED (catalizzatore) vengono aggiunti alle soluzioni pochi attimi prima del caricamento nel gel caster. 4

5 II GIORNO Preparazione dei campioni per SDS-PAGE I campioni da caricare sul gel vengono preparati aggiungendo un opportuno volume di sample buffer 5X, contenente blu di bromofenolo (BBF), utile per seguire la corsa elettroforetica, glicerolo, che rende più denso il campione consentendone la stratificazione sul fondo del pozzetto, beta-mercaptoetanolo, che riduce i ponti disolfuro delle proteine favorendone la denaturazione, sodio dodecilsofato (SDS), un detergente anfipatico denaturante che conferisce alle proteine una carica negativa. Sample buffer 5X 0.25 M Tris/HCl ph % SDS + 20% glicerolo M -mercaptoetanolo + blu di bromofenolo (BBF). I campioni da sottoporre ad analisi SDS-PAGE vengono allestiti in base alla seguente tabella: Estratto totale Frazione solubile Picco escluso campione 8 µl 8 µl 8 µl 24 µl 24 µl 24 µl 24 µl 24 µl Sample 6 µl 6 µl 6 µl 6 µl 6 µl 6 µl 6 µl 6 µl Buffer 5X H 2 O 16 µl 16 µl 16 µl V totale 30 µl 30 µl 30 µl 30 µl 30 µl 30 µl 30 µl 30 µl Risospendere accuratamente la frazione insolubile (pellet) in 600 µl di sample buffer 1X. Una volta allestiti i campioni, si denaturano le proteine incubando a 100 C per 5 minuti. 5

6 Corsa elettroforetica Caricare sul gel 25 µl di ciascuno dei campioni precedentemente preparati e 3 µl dello standard di peso molecolare Estratto totale Fraz. solubile Fraz. insolubile Picco escluso Ordine di caricamento Tampone di corsa Versare il tampone di corsa (25 mm Tris, 250 mm glicina, ph 8.3, 0.1% SDS) negli apparati elettroforetici Collegare gli apparati per elettroforesi ad un generatore di corrente, applicando una corrente costante di 20 ma per lastrina (amperaggio costante). Fermare la corsa quando il colorante tracciante (blu di bromofenolo) raggiunge il fondo del running gel. Il gel viene lavato in H 2 O distillata e colorato con Gel-CODE Blue, un colorante commerciale contenente blu Coomassie e successivamente decolorato in acqua. Dosaggio della concentrazione proteica mediante il metodo di Bradford (Bradford M., Anal. Biochem., 1976, 72, 248) La concentrazione proteica dei campioni della purificazione viene determinata mediante il metodo di Bradford. Questo tipo di dosaggio rappresenta uno dei metodi più sensibili e rapidi per la determinazione della concentrazione dei campioni biologici. Il reattivo contiene il Coomassie Brilliant Blue G-250, un colorante anionico. In ambiente acido le proteine reagiscono con il colorante carico negativamente formando un complesso di un colore che varia da rosso-bruno a blu che ha un massimo di assorbimento a una lunghezza d onda di 595 nm. Il numero di molecole di colorante legato è approssimativamente proporzionale al numero di proteine presenti. La misura ottenuta non è, tuttavia, assoluta, pertanto per quantificare le proteine è necessario calibrare il metodo. Viene preparata pertanto una retta di taratura 6

7 utilizzando quantità note di albumina di siero bovino (BSA) come proteina di riferimento. Miscele di reazione per saggio di Bradford Campioni per retta di taratura Bianco 2X BSA 0.5 µg BSA 1 µg BSA 2 µg BSA 4 µg BSA 6 µg BSA 0.1 µg/µl 5 µl 10 µl 20 µl 40 µl 60 µl H 2 O 500 µl 495 µl 490 µl 480 µl 460 µl 440 µl Reattivo di Bradford 500 µl 500 µl 500 µl 500 µl 500 µl 500 µl Dosaggio dei campioni di interesse Frazione Picco solubile escluso (1:10) (1:10) campione 5 µl 5 µl 20 µl 20 µl 20 µl 20 µl 20 µl H 2 O 495 µl 495 µl 480 µl 480 µl 480 µl 480 µl 480 µl Reattivo di Bradford 500 µl 500 µl 500 µl 500 µl 500 µl 500 µl 500 µl - Allestire contemporaneamente le miscele della retta di taratura e dei campioni, direttamente nelle cuvette. - Tappare le provette, mescolare per agitazione ed incubare per 5 minuti a temperatura ambiente. - Leggere l'estinzione a 595 nm per ciascun campione. - Allestire una retta di taratura riportando in ascisse i µg di proteina e in ordinate i corrispondenti valori di estinzione (ΔE). - Determinare i µg di proteina presenti in cuvetta dalla retta di taratura; dividendo i µg ottenuti per il volume in µl utilizzato per il dosaggio, si ricava la concentrazione proteica dei campioni analizzati. Se è stata effettuata una diluizione del campione, si dovrà tenere conto del fattore di diluizione. 7

8 - Riportare i valori nella seguente tabella: Frazione solubile Picco escluso ΔE μg μl mg/ml Dialisi Riunire le frazioni di eluizione più ricche in proteine e dializzare con una membrana da dialisi con cut off Dalton utilizzando 1 L di tampone Na 2 HPO 4 25 mm, NaCl 75 mm ph 7.4 al fine di eliminare il maltosio presente. La dialisi viene condotta a 4 C over night. 8

9 III GIORNO Recupero campione dializzato Trasferire in una provetta pulita i campioni di proteina dializzati. Dosaggio della concentrazione proteica di campioni dializzati (metodo di Bradford) Dosare il contenuto proteico del campione dializzato seguendo la tabella riportata Bianco 2X Campione dializzato campione 20 µl H 2 O 500 µl 480 µl Reattivo Bradford 500 µl 500 µl Calcolare la concentrazione del campione utilizzando la retta di taratura già ottenuta in precedenza Frazione purificata dializzata ΔE μg μl mg/ml Dosaggio di attività dell enzima trealasi Gli enzimi sono proteine in grado di catalizzare determinate reazioni biologiche, con un alta specificità per i loro substrati. La concentrazione enzimatica viene determinata in base alla velocità della reazione catalizzata, quindi in base alla velocità con cui il substrato viene trasformato in condizioni definite. La velocità della reazione catalizzata è direttamente proporzionale alla concentrazione dell enzima. La velocità della reazione viene seguita nel tempo misurando la scomparsa di substrato o la comparsa di prodotto. Per la misura dell attività, quindi, si seguono nel tempo le variazioni di un opportuna proprietà del substrato o del prodotto. 9

10 Il ph, la temperatura, cofattori o altri componenti della miscela di reazione possono influire sulla velocità della reazione catalizzata. L attività enzimatica, ovvero la velocità della reazione catalizzata, viene espressa in unità. Per convenzione generale e per tutti gli enzimi, si definisce attività internazionale (U) l attività enzimatica che, in condizioni definite di temperatura e di ph, trasforma una μmole di substrato al minuto. Le unità misurate vengono riferite ad un volume unitario del campione in esame o ai mg di proteine presenti nel campione. Il rapporto U/mL di campione viene detto attività relativa, mentre il rapporto U/mg di proteine viene indicato come attività specifica dell enzima. Molti substrati e prodotti assorbono la luce nel visibile o nell ultravioletto e molti dosaggi si basano sull interconversione NAD(P)+/NAD(P)H. Sia la forma ossidata sia la forma ridotta di questo nucleotide assorbono la luce a 260 nm, ma solo la forma ridotta assorbe a 340 nm. Questo diverso spettro di assorbimento permette di utilizzare questo nucleotide per dosaggi basati su metodi spettrofotometrici. Quegli enzimi che non utilizzano in modo diretto NAD(P)+/NAD(P)H possono essere comunque dosati sfruttando questo tipo di interconversione mediante reazioni accoppiate. In tali reazioni, l enzima che deve essere dosato è accoppiato ad un altro enzima che utilizza il sistema NAD+/NADH mediante un intermedio comune. Il dosaggio dell attività trealasica viene effettuato allo spettrofotometro mediante l accoppiamento della reazione catalizzata dalla trealasi con due reazioni catalizzate da enzimi ausiliari, Glucosio-6-P deidrogenasi (G6PDH) e Esochinasi (HK). Valutando l aumento di assorbanza di NADP in forma ridotta a una lunghezza d onda di 340 nm, l attività relativa dell enzima viene calcolata in base alla seguente formula: 10

11 U E min V ml d 2 V dove: ΔE/min= variazione di estinzione al minuto V tot = volume finale della miscela di dosaggio (µl) V c = volume di campione da dosare aggiunto (µl) ε 340 = coefficiente di estinzione molare del NAD(P)H (6.3 mm -1 cm -1 ) d= cammino ottico della cuvetta (1 cm) Il valore di U/ml va diviso per 2 in base alla stechiometria della reazione. 340 tot c Allestire le miscele di dosaggio dell attività trealasica come mostrato in tabella [Wegener et al., 2003]: Reagenti Concentrazione iniziale Concentrazione finale Volume Na + -Acetato, ph mm 120 mm 240 µl MgCl mm 10 mm 100 µl NADP + 10 mm 0.6 mm 60 µl ATP 40 mm 1 mm 25 µl Trealosio 200 mm 20 mm 100 µl G6PDH 115 U/mL 0.84 U/mL 8 µl HK 133 U/mL 1.34 U/mL 10 µl campione x µl Acqua 457-x µl Volume totale 1000 µl N.B.: i dosaggi enzimatici vengono condotti ad una temperatura costante (T ambiente) e in condizioni definite di ph, utilizzando concentrazioni saturanti del substrato, il trealosio. Calcolare un volume di campione contenente 4 μg di proteina trealasi in base alla concentrazione proteica del campione purificato e dializzato: il volume calcolato 11

12 viene utilizzato per il dosaggio di attività enzimatica sia per la frazione solubile sia per la frazione purificata e dializzata. La reazione parte con l aggiunta del trealosio, che quindi viene aggiunto per ultimo alle miscele di reazione. - Registrare la variazione di assorbanza nel tempo (2-3 minuti). - Calcolare il ΔE/min e utilizzare la formula riportata sopra - Calcolare U/mL e completare la seguente tabella: Frazione solubile Frazione purificata e dializzata ΔE/min U/mL Completamento della tabella di purificazione Vol. [Prot] Proteine Attività Attività Attività Resa Indice Campione (ml) mg/ml totali U/mL totale specifica % di mg tot U tot U tot /mg tot purificazione Frazione solubile Enzima puro 12

13 IV GIORNO Cinetica enzimatica Sull enzima purificato viene effettuata la determinazione dei parametri cinetici K m e V max. Vengono condotte diverse misure di attività enzimatica come descritto precedentemente, ma a diverse concentrazioni di substrato (0.125, 0.25, 0.5, 1, 5, 10 mm). La miscela di dosaggio dell attività trealasica viene allestita come mostrato in tabella: Reagenti Concentrazione iniziale Concentrazione finale Volume Na + -Acetato, ph mm 120 mm 240 µl MgCl mm 10 mm 100 µl NADP + 10 mm 0.6 mm 60 µl ATP 40 mm 1 mm 25 µl Trealosio 1.25, 2.5, 5, 10, 50, 100 mm 0.125, 0.25, 0.5, 1, 5, 10 mm 100 µl G6PDH 115 U/mL 0.84 U/mL 8 µl HK 133 U/mL 1.34 U/mL 10 µl Enzima x µl Acqua 437-x µl Volume totale 1000 µl La quantità di enzima per condurre l esperimento di cinetica enzimatica viene calcolata sulla base dell attività enzimatica del campione purificato e dializzato, espressa in U/mL, in modo tale che contenga 10 mu. La reazione parte con l aggiunta del trealosio. - Registrare la variazione di assorbanza nel tempo (2-3 minuti). - Calcolare il ΔE/min e utilizzare la formula riportata sopra - Calcolare U/mL e completare la seguente tabella: reazioni [trealosio] E/min U/mL (v o ) 1/[S] 1/v o (min -1 ) (mm min -1 ) (mm -1 ) (min mm -1 ) 13

14 mm mm mm 4 1 mm 5 5 mm 6 10 mm I punti sperimentali possono essere interpolati con l equazione di un iperbole, secondo l equazione di Michaelis-Menten: v 0 V K max m S S Per il calcolo di Km e Vmax si allestisce il grafico dei doppi reciproci, riportando i valori dei reciproci delle velocità iniziali in funzione dei reciproci delle corrispondenti concentrazioni di substrato. L'equazione dei doppi reciproci ha la seguente forma: 1 Km 1 1 v V V S 0 max max Ricavare i valori dei parametri cinetici K M e V MAX. 14

15 Determinazione della massa molecolare della trealasi di C. riparius mediante SDS-PAGE Sul gel colorato e decolorato, si misura la distanza di migrazione di ciascuna delle proteine marker caricate. Si riporta in grafico il logaritmo della massa molecolare delle proteine standard in funzione della migrazione relativa, allestendo una retta di taratura. Da essa si ricava la massa molecolare della proteina di interesse, dopo aver misurato la sua distanza di migrazione. L analisi del gel permette anche di valutare qualitativamente l andamento della purificazione e il grado di purezza della proteina. Calcolo della concentrazione molare per il calcolo K cat Sulla base del peso molecolare calcolare la concentrazione molare della trealasi. Una volta ottenuta la concentrazione molare, procedere con il calcolo della costante catalitica in base alla relazione: V max = [E] tot K cat La k cat rappresenta una misura della formazione di prodotto per mezzo della catalisi enzimatica: rappresenta il numero di molecole di substrato trasformate da una molecola di enzima in un minuto (min -1 ). 15

16 V GIORNO Effetti del ph sull attività enzimatica Il ph è un parametro che influenza l attività enzimatica. Si procede pertanto ad effettuare dosaggi di attività trealasica sul campione purificato in presenza di tamponi a ph differenti. Si allestiscono tre cuvette secondo lo schema di dosaggio seguito il terzo giorno utilizzando i seguenti tamponi: - MES 500 mm ph 5 - Na + -acetato 500 mm ph Tris-HCl 500 mm ph 8 Si procede alla rilevazione dell assorbanza allo spettrofotometro e si calcolano U/mL. Con i dati attenuti si costruisce una curva di attività in relazione al ph esprimendo i dati di attività in percentuale rispetto all attività riscontrata all optimum di ph pari a 6.5. Saggi di denaturazione termica La temperatura è un fattore che influenza l attività enzimatica. Si procede pertanto ad effettuare dosaggi di attività trealasica sul campione purificato in seguito al trattamento a differenti temperature (30 C, 40 C, 50 C, 60 C). Dopo aver incubato il campione, si effettua il dosaggio secondo lo schema seguito il terzo giorno. Con i dati ottenuti si costruisce una curva di attività in relazione alla temperatura, riportando i dati in percentuale rispetto all attività monitorata senza incubazione alle differenti temperature stabilite. 16