PROTOCOLLI del Lab di BIOLOGIA MOLECOLARE

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Fabiano Cappelli
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1 PROTOCOLLI del Lab di BIOLOGIA MOLECOLARE a.a. 2013/2014 GIORNO 1: A) Rivitalizzione dei batteri precedentemente trasformati con il vettore plasmidico di interesse B) Induzione con IPTG dell'espressione delle proteine di fusione alla GST C) Preparazione gel di SDS-PAGE D) Pellettare batteri indotti GIORNO 2: E) Lisi dei batteri F) Caricamento su gel di acrilammide dei lisati batterici G) Reazione di PCR H) Colorazione blu Coomassie gel di acrilammide GIORNO 3: I) Preparazione del gel di agaroso per la verifica dell'amplificazione dei prodotti di PCR L) Corsa elettroforetica M) Analisi dati 1

2 Purificazione di proteine di fusione alla GST da E. coli Ogni studente trovera' una piastra con colonie di batteri precedentemente trasformata con il DNA plasmidico codificante una determinata proteina di fusione alla GST (GST, GST- MIU2). PROCEDURA [alcuni passaggi verranno effettuati dai tecnici come indicato] Inoculo dei batteri trasformati (Verra' fatta dai tecnici il giorno prima). 1.Raccogliere con il puntale giallo una colonia di batteri dalla piastra # e inocularli in 3 ml di LB + Amp. GIORNO 1 A) Rivitalizzazione dei batteri (crescita O/N). 2. Agitare (vortex) la crescita O/N e trasferire 500 ul in 4.5 ml di terreno LB + Amp fresco (gia' preparato e mantenuto a 37 C). A campione, un tecnico misura la densita' ottica OD Incubare a 37 C con agitazione vigorosa. Dopo 45 min un tecnico preleva a campione 1 ml della coltura e ne verifica la densita' ottica OD 600 Lasciare crescere fino a OD B) Induzione con IPTG dell'espressione della proteina di fusione alla GST. 4. Prelevare 1 ml di coltura e trasferirlo in un tubo nuovo (1.5 ml) siglato #N.I. Lasciare in ghiccio. 5. Aggiungere alla restante coltura _ ul di 1M IPTG (per ottenere concentrazione di IPTG di 1mM) per indurre l'espressione del gene ricombinante. 6. Incubare a 37 C con agitazione vigorosa per h. 7. Intanto preparare il campione #N.I.: centrifugare per 60 sec a rpm il tubo #N.I, scartare il surnatante (SN) e congelare il pellet a - 20 C fino al giorno 2. C) Preparazione del gel di SDS-PAGE (usare guanti!!) I tecnici mostrano l'assemblaggio. Ogni gruppo assembla il proprio apparato e prepara il gel come da protocollo allegato (Vedi PAG. 4) Conservare il gel a +4 C fino all'utilizzo (giorno 2). D) Pellettare batteri indotti Al termine dell'induzione con IPTG, trasferire in ghiaccio la coltura indotta (dal punto 6). 9. Prelevare 1 ml di coltura e trasferirlo in un tubo nuovo (1.5 ml) siglato #I. 10. Preparare il campione #I.: centrifugare per 60 sec a rpm il tubo #I, scartare il surnatante (SN) e e congelare il pellet a - 20 C fino al giorno 2. 2

3 GIORNO 2 E) Lisi dei batteri N.I. e I. 11. Scongelare i pellet batterici (N.I. e I.) e risospendere ciascun pellet in 50 ul di Sample Buffer (SB). Bollire 5 min i tubi #N.I e #I. F) Caricamento dei campioni su gel e corsa elettroforetica 12. Caricare 20 ul di ciascun campione su gel SDS- PAGE. Rispettare il seguente ordine di caricamento: Gel 1 MW - 1N.I. - 1I. - 2N.I. - 2I. - 3N.I. - 3I. - 1N.I. - 4I. 13. Corsa elettroforetica (circa 1.5 h). I tecnici mostrano il disassemblaggio dell'apparato. Disassemblare l'apparato e trasferire con cura il gel in soluzione di blu Coomassie- STAINING (H) Lasciare circa min). Usare i guanti. ATTENZIONE ALLA FRAGILITA' DEL GEL!!! 14. Il gel verra' trasferito nella soluzione DESTAINING fino a completa decolorazione. Durante la corsa e la colorazione/decolorazione del gel, procedo con la fase successiva. G) Reazione di PCR (vedi PAG. 5) GIORNO 3 I) Preparazione del gel di agarosio - Sospendere 0.5 g di agarosio in 50 ml di TAE (Tris 40 mm, CH 3COOH 29 mm, EDTA 2 mm, ph=8). - Scaldare in forno a micro- onde fino a raggiungere la trasparenza della soluzione. - Lasciar raffreddare fino a ca. 50 C. - Aggiungere µl di GEL RED. - Colare nella vaschetta già montata con il pettine e lasciar solidificare. L) Corsa elettroforetica - Caricare i prodotti di PCR (e i relativi controlli, uno per gruppo di lavoro) su gel di agarosio Gel 1 MW - PCR#1 - PCR#2- PCR#3- PCR#4- PCR#5- PCR#6 - Contr1 Preparazione del campione da caricare: Su foglietto di Parafilm preparare il campione da caricare miscelando: - 10 ul di prodotto di PCR - ul di Loading Dye (6X) M) Analisi e discussione dei risultati ottenuti. 3

4 PREPARAZIONE GEL DI ACRILAMMIDE Pulire bene i vetri, facendo attenzione a non romperli (sono molto fragili). Manipolarli coi guanti, facendo attenzione a non toccarli mai con l'epidermide! A. Preparazione Running gel 1. Per preparare la soluzione al 10% di Polyacrylamide, aggiungere: 1.67 ml di 30% Acrylamide:Bis- Acrylamide (ATTENZIONE!!) 1.25 ml di 4X Lower Tris Buffer 2 ml di ddh2o volume finale 10 ml aggiungere 30 ul di 10% APS 2. aggiungere 10 ul di TEMED, agitare gentilmente e versare IMMEDIATAMENTE la soluzione. 3. coprire con ddh2o 4. lasciar polimerizzare per circa 30 min 5. togliere H2O B. Preparazione Stacking gel 6. miscelare come segue: 0.45 ml di 30% Acrylamide:Bis- Acrylamide (ATTENZIONE!!) 0.75 ml di 4X Upper Tris Buffer 1.8 ml di ddh2o volume finale 3 ml aggiungere 20 ul di 10% APS 7. aggiungere 10 ul di TEMED, agitare gentilmente e versare IMMEDIATAMENTE la soluzione. 8. posizionare il pettine 9. lasciare polimerizzare NB: APS induce la polimerizzazione di acrylamide e bis- acrylamide attraverso la produzione di radicali liberi. Il TEMED catalizza la formazione di radicali liberi da parte dell'aps, accelerando il processo di polimerizzazione. 4

5 REAZIONE DI PCR Templato: Primers per la PCR di clonaggio: Forward Reverse Tm: Forward Reverse Tm= Tm= Preparare la seguente miscela di reazione: DNA 20 ng Concentrazione delle soluzioni madre: Primer Senso 20 pmoli Primer Anti- Senso 20 pmoli Templato: 0.01 µg/µl Primer SE: 10 µm dntps 200 µm Buffer 1x Primer AS: 10 µm dntps : 2.5 mm/dntp=10mm Taq pol : 2,5 U/µl MgCl mm MgCl 2 : 25 mm Taq polimerasi 5 U Buffer : 5X H 2O q.b. 50µl IMPOSTAZIONE DEL TERMOCICLATORE Inserire la provetta nello strumento e far partire la reazione, secondo il seguente protocollo: 1 ciclo 25 cicli 1 ciclo 95 C 95 C 2:00 0:30 C 72 C 72 C 0:30 (1 min/kb) 7:00 4 C Terminata la reazione polimerasica controllare l avvenuta amplificazione dell inserto su gel di agarosio. 5

6 PREPARAZIONE GEL AGAROSIO - Sospendere 0.5 g di agarosio in 50 ml di TAE (Tris 40 mm, CH 3COOH 29 mm, EDTA 2 mm, ph=8). - Scaldare in forno a micro- onde fino a raggiungere la trasparenza della soluzione. - Lasciar raffreddare fino a ca. 50 C. - Aggiungere µl della soluzione di colorante. - Colare nella vaschetta già montata con il pettine e lasciar solidificare. 6

7 SOLUTIONS SDS Sample Buffer (1X) 0.1% (w/v) Bromophenol Blue 2% (w/v) SDS 10% (v/v) Glycerolo 100 mm DTT 50 mm Tris- HCl, ph 6.8 SDS Running Buffer (4X) 48 g of Tris base Add ddh2o to 4 liters 4 g SDS g Glycine Upper Tris Buffer (4X) ph to 6.8 using HCl Add ddh2o to 100 ml 6.06 g of Tris base 4 ml of 10% (w/v) SDS Lower Tris Buffer (4X) ph to 8.8 using HCl Add ddh2o to 500 ml g of Tris base 20 ml of 10% (w/v) SDS 0.5 M IPTG (Isopropyl beta-d-thiogalactopyranoside) 0.12 g/ml IPTG Sterilizzare per filtrazione Aliquotare e conservare a - 20 C PBS ph mm KCl 4.3 mm Sodium Phosphate Dibasic (Na 2HPO 4) 1.8 mm Sodium Phosphate Monobasic (KH 2PO 4) 137 mm NaCl Coomassie Staining Solution 0.18% (w/v) Coomassie Brilliant Blue 10% (v/v) Glacial Acetic Acid (CAUTION!) 25% (v/v) Methanol (CAUTION!) Coomassie Destaining Solution 10% (v/v) Glacial Acetic Acid (CAUTION!) 25% (v/v) Methanol (CAUTION!) 7

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