Preparazione dei campioni da inviare per il sequenziamento

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1 Preparazione dei campioni da inviare per il sequenziamento PCR preparativa Buffer 10x dntp 2mM Taq polimerasi Oligonucleotidi up e down 100 ng/ul Volume finale 2 ul/campione 2 ul/campione 0,5 U/campione 1 ul/campione 19 ul/campione -Aliquotare 19 ul in provette da PCR in ghiaccio. -Aggiungere il DNA (1 ul, 2-5 ng). Se il DNA è in agarosio: sciogliere a 90, trasferire a 60, pipettare 1 ul nella miscela di reazione. Chiudere le provette. -Accendere il termociclatore e far partire il programma. Quando raggiunge 80 C, mandare in pausa, inserire i campioni, chiudere e far ripartire (questo accorgimento migliora la specificità della reazione). Condizioni di PCR Condizioni consigliate: Denaturazione iniziale: 94 o C 45 sec. 30 cicli di: Denaturazione: Annealing: Elongazione 94 o C 45 sec. Tm-2 o C 45 sec. 72 o C 45 sec. (0.2-1Kb) o 60 sec. (1-2Kb). N.B.: Le temperature di denaturazione ed elongazione possono variare in base al tipo di DNA polimerasi che si utilizza. Verificare su gel che sia stata ottenuta una banda singola e netta. PCR aspecifiche, con più bande, o con bande poco definite, sono la causa di sequenze illeggibili. Purificazione dei frammenti di PCR Per la purificazione dei campioni è opportuno l utilizzo dei seguenti materiali: colonnine Micro-Bio-Spin (Biorad, product code: ) o piastre Multiscreen (Millipore cat. MAHVN4510) e resina Sepharose CL-6B (GE Healthcare product code: ) o resina SEPHADEX G-100 (GE Healthcare, product code: ). Quantificazione del DNA Una corretta quantificazione del DNA è molto importante per poter ottenere sequenze di buona qualità. Una scarsa quantità di DNA, infatti, genera delle sequenze con picchi bassi e determina un aumento del rumore di fondo, mentre un elevata quantità di DNA produce un segnale inizialmente forte che però decresce velocemente. Le preparazioni su colonnina danno DNA di elevata qualità. Se la preparazione e calibrata per produrre piu di 10 ug, si puo procedere alla misurazione spettrofotometrica in cuvette di tipo micro (2,5 ug in 500 ul generano una OD260 di 0,1). Il rapporto OD260/OD280 deve essere circa 1,8. Rapporti molto diversi indicano la presenza di impurezze. Per le minipreparazioni e le PCR, va invece usata una quantificazione fluorimetrica, molto piu sensibile alla presenza di DNA, ma meno sensibile alla presenza di impurezze. E assai importante calibrarli ogni

2 volta con un DNA a concentrazione nota (ad esempio DNA λ) assicurandosi che la quantità del DNA da misurare sia nel range di lettura lineare dello strumento. In assenza di un fluorimetro, il DNA può essere quantizzato su gel di agarosio. Utilizzando un minigel e possibile vedere bande anche di soli 10 ng. In tal caso, occorre utilizzare un DNA a concentrazione nota come standard, e caricarne varie diluizioni (ad es. 10, 30 e 100 ng). Nei templati preparati tramite PCR, si deve avere una resa minima di 5 ng/ul di reazione. Rese inferiori danno DNA più impuro e sequenze di cattiva qualità. Analisi di frammenti (SNPs, Microsatelliti) Genechron fornisce un servizio di analisi di frammenti mediante un sistema automatizzato ad elettroforesi capillare (ABI 3130XL o 3730, Life Technologies) ed effettua l analisi dei dati tramite software (Genemapper software, Life Technologies). L utente esegue una reazione di marcatura con oligonucleotidi fluorescenti (AFLP, microsatelliti, SNP, etc.) e la invia in un volume di 15 ul. Per marcare i primers si possono utilizzare, nella stessa reazione, fino a 4 fluorocromi differenti (set G5), destinando un fluorocromo al marcatore di peso molecolare. Genechron aggiunge il marcatore a metà del volume ed esegue l elettroforesi. Suggeriamo di effettuare una serie iniziale di prove su vostri campioni diluiti serialmente, in modo da calibrare la quantità inviata rispetto alle nostre condizioni di corsa. I files Genemapper vengono inviati all utente che li visualizza tramite un software apposito. Il set di filtri disponibile ed i relativi fluorocromi rilevati è il seguente: Set G5: 6FAM, VIC, NED, PET, LIZ (per SNP a 5 colori) I marcatori di peso molecolare disponibili sono i seguenti: Genescan 500-LIZ dye Size Standard: 16 frammenti compresi fra 35 e 500 basi (consigliato per la maggior parte delle applicazioni) Genescan 1200-LIZ dye Size Standard: 68 frammenti compresi fra 20 e Oligonucleotidi Primers standard (disponibili presso Genechron) Primer Sequenza Note M13 for TGTAAAACGACGGCCAGT Primers universali fiancheggianti il polylinker dei M13 rev CAGGAAACAGCTATGACC plasmidi puc, pbluescript, pgem e fagi M13 SP6 TAGGTGACACTATAGAATAC Primers universali fiancheggianti il polylinker dei T7 GTAATACGACTCACTATAG plasmidi pbluescript e pgem T3 CAATTAACCCTCACTAAAG Questi oligonucleotidi possono essere aggiunti da Genechron alla reazione di sequenza a costo zero su richiesta dell utente. La lista potrà essere aggiornata con nuovi primers di largo uso suggeriti dagli utenti. I primer non standard (disegnati e quantizzati dall utente) devono avere Tm compresa fra 50 C e 60 C e lunghezza fra 18 e 24 bp, anche se risultati non ottimali si possono ottenere anche con Tm e lunghezze maggiori. Lo step di annealing della reazione di sequenza viene effettuato a 48 C, per cui primers con Tm inferiori a 48 C non funzionano.

3 Calcolo della Tm e della quantità di oligonucleotide Tm= 2 C per ogni A o T + 4 C per ogni G o C 1 OD260=30 ug/ml oligo 1 pmole primer = 0,32 ng x n basi Disegno dei primers Scegliere un 19-20mero avente le seguenti caratteristiche: - niente stretch con più di 5 nucleotidi identici; - contenuto in GC: 40-60%; - nessuna zona complementare (per evitare strutture secondarie); - Calcolare la Tm (vd. sopra): deve essere preferibilmente compresa fra 50 C e 60 C; - Eventualmente allungare od accorciare il primer per ottimizzare la Tm (min 18 - max 24 basi); NB: Nella nostra esperienza, i primers PCR desalt forniti dalle maggiori ditte danno ottimi risultati senza bisogno di ulteriori purificazioni. Controllo del funzionamento dei primers Prima di inviare i primers insieme ai templati, è consigliabile controllare il loro funzionamento in una reazione di PCR, accertandosi che diano un amplificazione vigorosa e soprattutto una banda singola. Invio dei campioni: I campioni vanno inviati rigorosamente in un volume di 15 ul in provette o strip da PCR da 0.2 ml. Eventuali oligonucleotidi per la reazione di sequenziamento vanno aggiunti al campione e non inviati separatamente. Nel caso di invio in micropiastra, vanno utilizzate micropiastre da PCR di poliallomero (volume del pozzetto: 0.2 ml). La micropiastra va rigorosamente sigillata mediante tappini per strip al fine di evitare possibili evaporazioni contaminazioni incrociate dei campioni. Ogni invio fuori standard (provette di formato diverso, campioni liofilizzati) comportera un addebito di 1 /campione. Quantita raccomandate Frammento di PCR 9 ng /100 bp di lunghezza Plasmidi < 7 Kb 900 ng Plasmidi 7-15Kb 1500 ng Cosmidi e BAC 2100 ng Primer 9 pmoli (1) Volume finale: 15 ul (2) (1) 1 pmole primer = 0,32 ng x n basi. Aggiungere il primer alla reazione (non inviarlo in provetta separata). Nel caso si chieda l aggiunta di un primer universale Genechron, andrà indicato il nome nel modulo di richiesta sequenziamento. (2) La concentrazione finale di Tris o altri sali deve essere inferiore a 5 mm, quella di EDTA inferiore a 0,5 mm. Una concentrazione di sali eccessiva da sequenze corte (<400 basi). Corriere convenzionato Le spedizioni possono essere effettuate utilizzando il corriere SDA, con cui il laboratorio Genechron ha stipulato una convenzione. I costi molto vantaggiosi della convenzione con SDA verranno addebitati sul conto del cliente e sono validi per spedizioni in tutta Italia.

4 Nella maggior parte delle città, telefonando entro le 11 del mattino, il corriere ritira il campione entro il pomeriggio e consegna generalmente al nostro laboratorio entro le 15 del giorno successivo (2 giorni per isole e Calabria). Le provette, chiuse in un contenitore a tenuta (es. provetta tipo Falcon da 50 ml), e le piastre vanno inviate in busta imbottita. Per il ritiro è sufficiente: -Telefonare al numero SDA Richiedere il ritiro a domicilio, specificando che si tratta di spedizione in porto assegnato. -Specificare al corriere il codice cliente della convenzione SDA - Ylichron Srl (che gestisce il laboratorio Genechron) che è o la P. IVA della Società Ylichron Srl: Ylichron Srl C.R. ENEA Casaccia Via Anguillarese, 301 P. IVA: Mettere sulla busta l indirizzo completo riportato qui sotto: Genechron C.R. ENEA Casaccia (Ed. T4 Piano Terra) - Sacco Postale 026 Via Anguillarese 301 Al momento del ricevimento, Genechron avvertirà l utente tramite . Vi preghiamo di segnalarci via eventuali disservizi. Tempi di lavorazione I campioni arrivati entro le 11 dei giorni di lavorazione vengono processati immediatamente, con invio dei risultati entro la mattinata del giorno successivo.

5 Ordini ed amministrazione Parallelamente all invio dei campioni da sequenziare va curata l emissione, da parte della propria amministrazione, di un regolare ordine. Per ordini inferiori a 100 euro verrà applicata una sovrattassa di 10 euro. Nell ordine vanno riportati i seguenti dati: Nome del Richiedente Codice Utente Tipo dei servizi richiesti (o tipo abbonamento) Importo IVA esclusa L ordine va inviato a: Ylichron Srl C.R. ENEA Casaccia Via Anguillarese, info@genechron.com P.IVA: IBAN: IT 38 S L ordine va anticipato via mail all indirizzo : info@genechron.com. I prezzi in abbonamento vengono attivati al momento di arrivo dell ordine. Gli utenti riceveranno una conferma via dell avvenuta ricezione dell ordine, con relativo estratto conto. Gli utenti riceveranno il conto aggiornato del proprio ordine ad ogni esaurimento del credito e ad ogni ricevimento di un ordine nuovo. L invio dell estratto conto può essere richiesto via (info@genechron.com). Istruzioni per il saldo delle fatture: Il pagamento deve essere effettuato mediante bonifico bancario. Le spese bancarie sono a carico del cliente e non possono essere dedotte dall'importo totale. Si prega di citare il numero della fattura nella causale del bonifico.