Real Time PCR. La PCR Real Time è in grado di misurare in tempo reale la concentrazione iniziale di una sequenza target in un campione biologico.

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1 eal Time PC La PC eal Time è in grado di misurare in tempo reale la concentrazione iniziale di una sequenza target in un campione biologico. Gli strumenti per PC eal Time, oltre a fungere da termociclatori, eccitano i fluorocromi presenti nei campioni e convogliano quindi la fluorescenza emessa in risposta fino ad uno spettrografo. Appositi software acquisiscono lo spettro di emissione di ogni singolo campione per tutta la durata della PC e convertono la variazione di fluorescenza del reporter in una rappresentazione in tempo reale della cinetica d amplificazione. Il calcolo della quantità di DNA dei campioni incogniti viene effettuata determinando il ciclo della PC (ciclo soglia, Ct) in cui viene raggiunto il valore soglia di fluorescenza del reporter e dove cioè i segnali di amplificazione specifici sono separabili da quelli del rumore di fondo del sistema. Il numero dei cicli necessari perché un campione raggiunga il suo Ct è inversamente proporzionale al numero di copie target presente inizialmente. Fluorescenza Cicli di amplificazione 1

2 Il vantaggio in termini di precisione e di intervallo di quantificazione rispetto alle PC tradizionali, è dovuto alla possibilità di quantificare il DNA al ciclo soglia, che è sempre calcolato nella fase esponenziale della reazione PC, fase in cui i reagenti sono ancora lontani dall esaurimento e gli elementi di variabilità sono così ridotti al minimo. SYB Green: principio SYB Green I Utilizza una molecola fluorescente non specifica che si lega al solco minore del DNA 2

3 SYB Green All inizio del processo di amplificazione, la miscela di reazione contiene DNA denaturato, primers e la molecola fluorescente SYB Green Dopo l annealing dei primers, si legano poche molecole fluorescenti alla doppia elica. SYB Green Durante l elongazione si verifica un aumento di fluorescenza che corrisponde all aumento del numero di copie dell amplicone 3

4 SYB green Metodica semplice Possono essere utilizzati primers in uso in qualitativa Non costosa Non-specifica La molecola fluorescente si lega random a tutte le doppie eliche, includendo i dimeri di primers È necessario ottimizzare la metodica per evitare la f o r m a z i o n e d i p r o d o t t i a s p e c i f i c i In seguito sono state utilizzate delle sonde caratterizzate dal fatto di essere un oligonucleotide dotato sia di un fluorocromo reporter che di un quencher. uando la sonda è intatta, la fluorescenza del reporter è spenta dalla vicinanza del quencher; ma quando la sonda è rotta dalla Taq polimerasi, l attività dei fluorocromi viene rilevata. Uno dei saggi più diffusi per PC real-time è il sistema TaqMan, il quale utilizza una sonda contenente due fluorocromi: FAM (6-carboxy-fluorescein) come reporter fluorescente legato covalentemente all estremità in e TAMA (6-carboxy-tetramethyl-rhodamine) come quencher fluorescente legato covalentemente all estremità in 3. Se è avvenuta l ibridazione, l attività esonucleasica della Taq polimerasi rompe la sonda interna durante la fase di estensione, emettendo un segnale di fluorescenza. La possibilità di utilizzare vari tipi di fluorocromi per marcare sonde diverse consente di rilevare contemporaneamente più di una sequenza target in una sola reazione, realizzando così una reazione in multiplex. 4

5 Sonda TaqMan Presenta all estremità un fluoroforo eporter ed all estremità 3 una molecola uencher 3 eporter-uencher EPOTE (): fluorocromo ad alta energia che emette fluorescenza 3 UENCHE (): fluorocromo a bassa energia che spegne la fluorescenza del reporter 3 Se e si trovano vicini, spegne l'effetto di perchè i fotoni di vengono assorbiti da eal-time PC: attività >3 esonucleasica

6 L aumento di fluorescenza del eporter è direttamente proporzionale al numero di ampliconi generati Forward primer Probe everse primer eal-time PC: la reazione COMPONENTI DELLA EAZIONE: 1) DNA target 2) DNA polimerasi 3) Due oligonucleotidi 4) dntps 5) Probe fluorescente un eal-time thermal cycle 3 min 95 C 15 s 50 cycles 50 C Activates Amplitaq Gold 55 C 65 C 1 min 2 min 30 s Activates UNG (Uracile N-Glicosilasi) 6

7 Sonde FET (Fluorescence esonance Energy Transfer) Simili alle sonde TaqMan perché si legano al DNA bersaglio e vengono idrolizzate, ci sono però due sonde ognuna marcata con un solo fluorocromo (accettore e donatore) uando le sonde non sono legate alle sequenze target il segnale fluorescente proveniente dall'accettore non è rilevato donatore accettore Durante lo step di annealing PC, entrambe le sonde FET ibridizzano alle sequenze target: ciò avvicina il fluoroforo donatore all'accettore permettendo il trasferimento di energia tra i due fluorofori e la produzione di un segnale fluorescente da parte dell'accettore che viene rilevato. 7