PCR LIMITI. PCR Quantitativa

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1 PCR QUANTITATIVA

2 PCR LIMITI -Falsi Positivi -Analisi Qualitativa NUOVE PROSPETTIVE PCR Quantitativa

3 PCR QUANTITATIVA Misura l'amplificazione in tempo reale durante la fase esponenziale della PCR, quando cioè l'efficienza di amplificazione è influenzata minimamente dalle variabili di reazione, permettendo di ottenere risultati molto più accurati rispetto alla PCR tradizionale "end point.

4 PCR Quantitativa E in grado di analizzare diversi tipi di fluorescenza emessa da: coloranti intercalanti ( es. SYBR green), che si legano in maniera aspecifica a tutto il DNA sonde ad ibridazione, specifiche per il frammento di interesse, marcate con molecole fluorescenti Dual-labeled(come le sonde TaqMan) Molecularbeacons Scorpion Sonde FRET(Fluorescence Resonance Energy Transfer)

5 Scala lineare Cinetica di amplificazione Scala logaritmica Numero di molecole Campione 1 Campione Campione 1 Campione Cicli di amplificazione 1 2 Reazione fermata a 8 cicli Reazione fermata a 15 cicli

6 RT-PCR quantitativa Rilevamento della fluorescenza associata all amplificazione Il prodotto di PCR non viene analizzato su gel di agarosio Analisi del prodotto di fluorescenza tramite computer Plot lineare Incremento di fluorescenza Cicli di PCR

7 Analisi tramite software

8 Plot di amplificazione Normalised reporter fluorescence(r n ) Linea soglia scelta d a l l o p e r a t o r e In maniera da intersecare le curve di tutti i campioni nella f a s e e s p o n e n z i a l e Indica il valore al di sopra del quale inizia l accumulo di un a m p l i f i c a t o PCR cycle number E ilciclodellareazionedi amplificazione in cui il segnale di fluorescenza del campione è maggiore rispetto a quello della Threshold

9 Quantificazione ASSOLUTA i campioni sono quantificati in modo assoluto Necessita di standard di cui si conosce la concentrazione assoluta (utilizzo di una standard curve) Per tutti gli unknowns devono essere saggiate identiche quantità di campioni RELATIVA la quantificazione viene effettuata paragonando i C T Necessita di controlli endogeni (non si utilizza una standard curve) Gli unknowns vengono quantificati paragonando il loro C T con quello del controllo endogeno

10 Ct 35 Quantitativa assoluta unknown sample 3500 copies log 10 quantity Il valore così ottenuto viene normalizzato rispetto a quello di un gene espresso costitutivamente (β-actina, GAPDH, ATPs, β 2 etc)

11 Quantitativa relativa Plot di amplificazione Control Sample Numero di cicli C T

12 Allestimento PCR Quantitativa Piatra ottica96well Tappi ottici Pellicola ottica

13 Impostazione piano di lavoro per TaqMan RT- PCR Standard Non template Control Non amplification Control Unknown= Campione

14 Analisi dei Risultati 1 2 3

15 Valutazione dei Ct

16 STANDARD CURVE mrna Plasmid dilutions: (insert = ABL) copies copies copies copies - 10 copies 02/02

17 Curva degli Standard

18 Normalizzazione dei Dati La normalizzazione dei dati è essenziale ai fini di una quantizzazione efficace. Metodo di quantizzazione del RNA: A260: Conveniente ma non specifico; Ribogreen/Etidio Bromuro: Sensibile, specifico ma non efficace Gene Housekeeping: valutazione qpcr di un gene sempre espresso nel tessuto di interesse. Numero di copie normalizzate= Numero Copie Gene X100 Numero Copie Gene Housekeeping

19 SYBR Green I Dye Utilizza una molecola fluorescentenon non specifica chesi legaal al solco minore del DNA Viene aggiunto alla PCR Mix assieme ai reagenti di una PCR standard Durante la PCR: 1.Si lega ai prodotti di DNA a doppio filamento 2.Il segnale fluorescente emesso (λdi 530 nm) aumenta proporzionalmente all aumento di dsdna Applicazione: analisi quantitative

20 1.DENATURAZIONE No fluorescenza 2.ANNEALING sviluppa fluorescenza con l annaeling dei primers 3. ELONGAZIONE Durante l elongazione si verifica un aumento di fluorescenza che corrisponde all aumento del numero di copie dell amplicone

21 SYBR green Metodicasemplice Possono essere utilizzati primers in uso in qualitativa Non costosa Non-specifica La molecola fluorescente si lega random a tutte le doppie eliche, includendo i dimeri di primers È necessario ottimizzare la metodica per evitare la formazione di prodotti aspecifici. Controllo della spacificità mediante le curve di melting.

22 Curvadi dissociazione Dopo l'amplificazione, i campioni vengono riscaldati (65 c 95 c) e la variazione dell'energia di fluorescenza viene monitorata per generare una curva di dissociazione Prodotto aspecifico

23 PCR Real-time Sistema LightCycler

24 Tecnica di PCR Fluorescente in Real-time Consente di effettuare PCR in tempi estremamente brevi e di rivelare i prodotti di amplificazione in tempo reale i prodotti di amplificazione vengono marcati con sostanze fluorescenti nel corso della PCR

25 Applicazioni 1. Analisi qualitative: variazioni di sequenza note in geni target umani genotipizzazione ed identificazione di agenti patogeni 2.Analisi quantitative: quantificazione di carica virale studi di espressione genica

26 Il sistema LightCycler è composto da 1. Termociclatorea camera cilindrica incremento di temperatura: C/s accuratezza di temperatura:+/-0.4 C tempo di corsa: 30 cicli in 20 min. 2. Fluorimetroper microvolumimunito di sofisticate lenti ottiche 3. PC con relativo softwareper monitorare la corsa (PCR) on-line ed in real-time

27 1. Tubi di reazione: capillari in vetro borosilicato 2. Volume di reazione: µl 3. Rotore: capienza di 32 capillari

28 Format fluorescenti La visualizzazione in real time dell andamento della PCR (incremento dei prodotti di amplificazione) è resa possibile dall impiego di sostanze fluorescenti che si legano agli amplificati Il sistema LC può lavorare con 2 diversi format fluorescenti: Il fluoroforosybr Green I Sonde d ibridazione o sonde FRET

29 Sonde d ibridazione o FRET Coppia di oligonucleotidi a singolo filamento e sequenza-specifici (cioè, costruite in modo da essere complementari a due brevi sequenze interne del frammento di dsdna da amplificare) Sono legate all estremità a specifici marcatori fluorescenti(fluorofori) Vengono aggiunte alla PCR Mix, oltre alla coppia di primers di una PCR standard

30 Sonde FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) Simili alle sonde TaqMan perché si legano al DNA bersaglio e vengono idrolizzate, ci sono però due sonde ognuna marcata con un solo fluoroc romo (acc etto re e donatore) Quando le sonde non sono legate alle sequenze target il segnale fluorescente proveniente dall'accettore non è rilevato donatore accettore Durante lo step di annealing PCR, entrambe le sonde FRET ibridizzano alle sequenze target: ciò avvicina il fluoroforo donatore all'accettore permettendo il trasferimento di energia tra i due fluorofori e la produzione di un segnale fluorescente da parte dell'accettore che viene rilevato

31 Sonde d ibridazione o FRET Fluoresceina LC Red Sonda sensor Sonda anchor P 3 3 Amplicone 5 Sonda sensor o di mutazione Sonda anchor Estremità 3 Fluoresceina (Fluoroforo donatore) Fosfato (all OH- libero) Estremità 5 Libera LC Red (Fluoroforo accettore)

32 La sonda sensor o di mutazione, pur essendo destinata ad ibridare con la sequenza variabile (contenente o meno l eventuale mutazione) è stata costruita in modo da essere complementare alla sequenza wild type Fluoresceina LC Red Sonda sensor Sonda anchor P 3 3 mutazione Amplicone 5 La sonda anchor è complementare ad una sequenza prossima a quella in cui è presente l eventuale mutazione (1-5 nucleotidi di distanza)

33 Fluorescent Resonance Energy Transfer (FRET) LED Eccitazione FRET Emissione P 3 3 Amplicon 5 Fluoresceina(Fluoroforo donatore) LC Red(Fluoroforo accettore)

34 EXCITATION NON DETECTED EMISSION EXCITATION FRET DETECTED EMISSION AMPLICON AMPLICON Annealing 1-5nt

35 Real-time PCR con sonde FRET

36 Applicazioni delle sonde FRET 1) Melting curve analysis (analisi qualitativa) per: - variazioni di sequenza note in geni target umani -identificazione e genotipizzazione di agenti patogeni (rivelazione di sequenze target) 2) Analisi di specifiche sequenze (analisi quantitativa)

37 Real-time PCR con sonde FRET e Melting curve analysis 1. Preparazione della PCR mix 2. Amplificazione mediante Real time-pcr della sequenza target di DNA contenente la mutazione di interesse 3. Genotipizzazione mediante Melting Curve Analysis

38 PCR Melting curve analysis

39 Melting curve analysis la temperatura di fusione (o di melting, Tm): T alla quale metà delle sequenze complementari sono ibridate e dipende dal grado di omologia esistente fra le due sequenze ibridate Fluoresceina 3 5 Sonda sensor 3 mutazione Amplicone 5 La Tm è inferiorein presenza di una nontotale complementarietà fra le due sequenze (mismatch) rispetto ad una complementarietà perfetta Ogni variazione di sequenza nella regione della sonda sensor determina un abbassamento della Tm (Es: la sostituzione di una singola base determina una differenza di Tm di 2-10 C)

40 Genotipo wild type totale complementarietà fra sonda sensor e templato stabilità e Tm dell ibrido maggiore Genotipo mutato non totale complementarietà tra sonda sensor e DNA destabilizzazione dell ibrido riduzione della Tm dell ibrido

41 Incremento progressivo della T (65 C 95 C) raggiungimento della Tm dell ibrido sonda sensor-templato dissociazione della sonda sensor dal DNA templato no contiguità fra i due fluorofori fine del fenomeno FRET riduzione della fluorescenza (decadimento della fluorescenza)

42 Genotipo wild type totale complementarietà fra sonda sensor e templato stabilità e Tm dell ibrido maggiore Genotipo mutato non totale complementarietà tra sonda sensor e DNA destabilizzazione dell ibrido riduzione della Tm dell ibrido Per il genotipo mutato il decadimento della fluorescenza avverrà ad una T inferiore rispetto ad un genotipo wild type

43 Rappresentazione grafica della Melting curve analysis Il decadimento della fluorescenza rivelato dal fluorimetro sarà visualizzato mediante un sistema di assi cartesiane con: in ascissa le temperature in gradi centigradi in ordinata la derivata negativa dei valori di fluorescenza (-df/dt)

44 Nel sistema di assi cartesiane, il decadimento della fluorescenzasarà rappresentato sottoforma di picchi di melting, l analisi delle quali permette la genotipizzazione del paziente

45 Melting curve analysis Genotipizzazione A seconda del genotipo del paziente analizzato, il grafico mostrerà tre diversi tipi di curve, corrispondenti a tre genotipi differenti: Genotipo omozigote wild type un unica Tm e, quindi, un solo picco di dissociazione Genotipo omozigote mutato un unica Tm, inferiore rispetto a quella del wild type e, quindi, un unico picco di dissociazione Genotipo eterozigote due Tm, una per l allelewildtype el altra per l allele mutato (più bassa) cui corrispondono, quindi, due picchi di dissociazione

46 mut/mut wt/wt wt/mut Genotipizzazione mediante Melting curve analysis

47 Melting curve analysis: controllo di qualità Per eseguire una genotipizzazione priva di ambiguità è necessario analizzare ad ogni seduta un controllo negativo ed un controllo positivo Controllo negativo L analisi della curva di melting dovrebbe sempre fornire un risultato negativo: assenza di sequenze target a cui le sonde possono legarsi no FRET no decadimento della fluorescenza graficamente, nessun picco di melting N.B. In caso contrario, la seduta non è valida e l intera procedura deve essere ripetuta Controllo positivo E costituito da un eterozigote di riferimento L analisi della curva di melting dovrebbe visualizzare sempre due picchi di melting (eterozigosi) N.B. In caso contrario, la seduta non è valida e l intera procedura deve essere ripetuta

48 Il Sistema LightCycler per l analisi delle varianti polimorfiche associate a trombofilia La trombofilia ereditaria è una predisposizione genetica alla trombosi I geni coinvolti sono geni di suscettibilità poiché non rappresentano la causa primaria della malattia, come nel caso dei disordini mendeliani, ma interagiscono in maniera sinergica con fattori ambientali per il manifestarsi della patologia Malattia genetica multifattoriale

49 Trombosi L evento trombotico è generalmente conseguenza di un alterazione primitiva o secondaria del fisiologico equilibrio emostatico Bilancia emostatica = equilibrio tra fattori procoagulanti ed anticoagulanti I fattori anticoagulanti normalmente tendono a prevalere, assicurando un accurato controllo in diversi punti della cascata coagulativa Il rischio di trombosi aumenta quando la bilancia emostatica è spostata in favore della coagulazione

50 Bilancia emostatica

51 Varianti polimorfiche associate a trombofilia Variante G1691A del fattore V, detta fattore V Leiden rappresenta il principale fattore di rischio trombotico e risulta in una resistenza alla proteina C attivata Variante protrombina G20210A, associata ad aumentati livelli plasmatici di tale fattore della coagulazione Variante C677T della metilentetraidrofolatoreduttasi (MTHFR), correlata ad un incremento dei livelli plasmatici di omocisteina che inducono un danno endoteliale cronico

52 La variante genica fattore V Leiden

53 La variante protrombina G20210A

54 Ruolo della MTHFR nel metabolismo dell omocisteina

55 L indagine diagnostica molecolare per l identificazione delle varianti polimorfiche associate a trombofilia aiuta a stimare in termini probabilistici il rischio di trombosi N.B. Deve essere affiancata da anamnesi familiare e personale per definire l esposizione a fattori di rischio acquisiti! In pazienti già colpiti dall evento trombotico l identificazione di una o più mutazioni permette di: chiarire la causa dell evento ottimizzare i tempi della profilassi secondaria della trombosi venosa (durata della terapia anticoagulante e necessità di prevenzione delle situazioni a rischio) estendere lo screening ai familiari del probando L identificazione dei portatori asintomatici permetterà loro di giovarsi di una adeguata profilassi primaria in concomitanza con situazioni a rischio

56 L identificazione e la genotipizzazione delle varianti polimorfiche associate a trombofilia è particolarmente indicata in pazienti con: precedenti episodi di tromboembolismo venoso o trombosi arteriosa poliabortività precedenti episodi di trombosi in gravidanza tromboflebite o trombosi placentare intendono assumere contraccettivi orali diabete

57 L analisi dei polimorfismi associati a rischio trombotico mediante il sistema LightCycler si articola in quattro step: 1. Estrazione del DNA da sangue periferico 2. Quantificazione del DNA con tecnica spettrofotometrica 3. PCR real-time e Melting Curve Analysis 4. Interpretazione dei risultati

58 Melting curve analysis della mutazione puntiforme G20210A del gene del fattore II Genotipo omozigote mutato un unico picco di melting a 49 C ± 2.5 C Genotipo omozigote wild type un picco di melting a 59 C ± 2.5 C Genotipo eterozigote due picchi di melting con i relativi valori a 49 C e 59 C, rispettivamente. Il Δt tra questi due picchi di melting è di 10 C ± 1.5 C

59 Infezioni da HSV1/HSV2 L HSV (Herpes virus simplex) é l agente eziologico responsabile della dermatosi vescicolare Esistono due differenti tipi virali: Tipo I, responsabile dell Herpes labialis Tipo 2, responsabile dell Herpes genitalis

60 Infezioni da HSV1/HSV2 Solitamente: Herpesvirus tipo 1 presenta localizzazioni labiali ed orofaringee Herpesvirus tipo 2 coinvolge la regione genitale Tuttavia, i due tipi di virus possono essere riscontrati in tutte le sedi in relazione al tipo di contatto Trasmissione verticale di HSV2 può verificarsi durante tutta la gravidanza, sia in corso di infezione primaria che ricorrente

61 Diagnosi molecolare delle infezioni da HSV1/HSV2 La sintomatologia in genere è molto grave: ritardo della crescita e dello sviluppo psicomotorio calcificazioni intracraniche, microcefalia, convulsioni lesioni cutanee alcuni bambini presentano interessamento oculare

62 Diagnosi molecolare delle infezioni da HSV1/HSV2 La diagnosi di certezza si può ottenere mediante: isolamento del virus (3 gg) più rapidamente, con analisi qualitativa mediante Real-time PCR Il kit Roche per l analisi qualitativa di HSV ½ permette: rapida identificazione del virus HSV (~85 min.) diagnosi differenziale fra HSV1 e HSV2 (tipizzazione in base ad una variazione di sequenza del gene codificante la DNA polimerasi virale) simultanea rivelazione di un Controllo Interno di qualità (mediante Dual-color detection)

63 Procedura diagnostica 1. Estrazione del DNA da colture cellulari, tamponi, plasma, siero ed altri materiali biologici 2. Real-time PCR e sonde FRET Amplificazione di una sequenza target del gene della DNA polimerasi La PCR mix conterrà una coppia di primers ed una coppia di sonde FRET 3. Tipizzazione mediante Melting curve analysis Le Tm degli ibridi sonda sensor/hsv1 e sensor/hsv2 sono differenti (differenti picchi di melting)

64 Diagnosi molecolare delle infezioni da HSV1/HSV2 HSV DNA pol Stessa coppia di primers per HSV 1 e 2 Sonda donor complementare a HSV-2 no mismatch HSV-2 Amplicone HSV-1 mismatch

65 HSV 2 HSV C HSV 1 HSV 1 HSV C HSV 1

66 HSV1/HSV2 - Melting curve analysis HSV1 HSV2 I campioni positivi per HSV1 mostrano un picco di melting a 53.9 C I campioni positivi per HSV2 mostrano un picco di melting a 67.1 C I campioni negativi non mostrano alcun picco di melting

67 Vantaggi della LightCycler qualitativa Risparmio di tempo: PCR estremamente rapide, 20 minuti per 30 cicli Riduzione delle contaminazioni: l amplificazione e la rivelazione avvengono nel medesimo capillare chiuso Semplicità d'uso Standardizzazione delle metodiche Completa automazione delle fasi di amplificazione e rivelazione Analisi contemporanea di più campioni Elevata riproducibilità Elevata sensibilità

68 PCR Real-time Sistema TaqMan

69 5 NUCLEASE ASSAY USING TAQMAN PROBE 1 : : Elongation Step of of Pcr FAM= 6-carbossifluoresceina Forward primer R Q R = Reporter Q = Quencher TAMRA= 6-carbossitetrametilrodamina Reverse primer 02/02

70 5 NUCLEASE ASSAY USING TAQMAN PROBE 2 : : Cleavage of of the Fluorogenic Probe R Q R = Reporter Q = Quencher Forward primer Reverse primer 02/02

71 5 NUCLEASE ASSAY USING TAQMAN PROBE 3 : : Elongation step completed R R = Reporter Q = Quencher Q Forward primer Reverse primer 02/02

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74 Forward Probe Reverse

75 Allelic Discrimination Assay For Allele 1 - only VIC dye signal is generated FAM A C Q VIC G C Q For Allele 2 - only FAM dye signal is generated FAM A T Q VIC G T Q

76 Molecular Beacons Sonda oligonucleotidica a forma di forcina L oligoha un fluoroforoad unaestremitàedun quencher all altra Il loopè complementare alla sequenza target, interna ai primers di PCR Lo stem è costituito dalle estermità complementari tra loro In assenza della sequenza target, la sonda rimane chiusa e il quencher blocca l emissione del vicino fluoroforo.

77 Molecular Beacons Durante lo step di annealing PCR, la sonda ibridizza alla sua sequenza target: ciò separa il colorante fluorescente dal reporter, producendo un segnale f l u o r e s c e n t e EXCITATIONE FRET La quantità di fluorescenza prodotta ad ogni ciclo, o dopo la PCR, dipende dalla quantità di prodotto specifico i n q u e l d a t o m o m e n t o ANNEALING Amplicon A differenza delle sonde TaqMan, le molecular beacons non vengono distrutte durante la reazione di amplificazione per cui possono reibridizzarsi durante il successivo ciclo

78 Molecular Beacons: come funzionano Denaturazione: fluorescenza non specifica dovuta a denaturazione della sonda Annealing: si sviluppa fluorescenza solo se la sonda ibrida con il target specifico Estensione: la sonda si dissocia dal target Lettura della fluorescenza (Plate Read): in fase di annealing Se la sondaè disegnatacorrettamente, è sufficienteilmismatch di unasola base per impedire l ibridazione con il target. Applicazione: SNP

79 Probes : Scorpions La progettazione delle scorpion probes è simile a quella delle molecular probes, con la differenza che al 3 terminale del probe vi è una sequenza, PCR primer, che è specifica per l estensione del target Questa sequenza è legata al 5 terminale di un primer per mezzo di un blocker

80 Probes : Scorpions Step 1 Lo Scorpions primer è esteso su un target di DNA Scorpions primer Probe Target di DNA

81 Probes : Scorpions Step 2 Durante il processo di denaturazione si verifica l allontanamento del quencher dal reporter e del primer di innesco dal DNA target R Q Primer di innesco DNA target

82 Probes : Scorpions Step 3 R a f f r e d d a n d o s i lo S c o r p i o n e s t e s o s u b i s c e un riarrangiamento interno ed emette fluorescenza in maniera target specifica. Un primer non esteso viene quenciato

83 Scorpions Probes The probe contains a 5'end reporter dye and an internal quencher dye directly linked to the 5'end of a PCR primer via a blocker. The blocker prevents Taq DNA polymerase from extending the PCR primer.

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85 Step 1: Lo Scorpions primer è estesosuun target di DNA Step 2-3: Durante ilprocessodi denaturazionesiverifical allontanamentodel quencher dalreporter e del primer di innescodaldna target. Il probe Scorpion riannilandosisuse stessopresentaquencher e reporter distanziati. Lo strumento registra l emissione di fluorescenza.

86 Riassumendo: Metodi di rilevamento della fluorescenza SYBR Green TaqMan Molecular Beacons Scorpion probe